(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011093238.5
(22)申请日 2020.10.13
(71)申请人 烟台大学
地址 264005 山东省烟台市莱山区清泉路
32号
(72)发明人 许卉 杨昕 李志勇 许晓蒙
孙发鑫 李艳丽 孙正
(51)Int.Cl.
C12P 17/06(2006.01)
(54)发明名称
一种高效快速制备淫羊藿次苷II的酶解方
法
(57)摘要
本发明提供一种高效快速制备淫羊藿次苷
II的酶解方法。该方法包括以下步骤：以淫羊藿
后加入蜗牛酶在水性缓冲溶液体系中进行酶解
反应，使淫羊藿苷C 7位的O ‑葡萄糖苷键快速定向 水解，酶解反应产物经常规后处理纯化，即得所
简便、条件温和的优点，而且物料来源丰富易得、
经济环保、易于放大生产，克服了现有技术的诸
多不足。权利要求书1页 说明书7页CN 112176008 A 2021.01.05
C N 112176008
A
1.一种高效快速制备淫羊藿次苷II的酶解方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）底物溶液制备：取淫羊藿苷适量加溶剂溶解得底物溶液，其中，所述溶剂为含二甲基亚砜体积比不低于80%的水性缓冲溶液；
（2）酶溶液制备：取蜗牛酶适量，加水性缓冲溶液溶解得酶溶液，所述水性缓冲溶液pH 值为5.0～7.0；
（3）酶解反应：将步骤（2）得到的酶溶液加入到步骤（1）得到的底物溶液中于水性缓冲溶液介质中进行酶解反应，并且，所述水性缓冲溶液介质的酶解反应体系中包含所述二甲亚砜的体积比不超过5%，所述酶解反应的蜗牛酶与底物淫羊藿苷重量比为0.5～2.0：1；酶解反应温度控制为20℃～50℃；酶解反应时间为1小时～8小时；
（4）后处理与纯化：将步骤（3）得到的酶解反应产物纯化后即得到淫羊藿次苷II。
2.根据权利要求1所述酶解方法，其特征在于步骤（2）中所述水性缓冲溶液为醋酸-醋酸钠缓冲液，且pH值为5.0～6.0。
3.根据权利要求1所述酶解方法，其特征在于步骤（3）中进行酶解反应的蜗牛酶与底物淫羊藿苷重量比为0.8～1.0：1；所述水性缓冲溶液介质的酶解反应体系中的底物淫羊藿苷的浓度不低于2mg/mL；酶解
反应温度为30℃～40℃；酶解反应时间为2小时。
4.根据权利要求1或3所述酶解方法，其特征在于所述水性缓冲溶液介质的酶解反应体系中包含体积比不超过1%的二甲亚砜。
5.根据权利要求1所述酶解方法，其特征在于，所述步骤（4）中纯化方法为离心、过滤、柱层析、重结晶、溶剂萃取方法中的一种或几种。
权 利 要 求 书1/1页CN 112176008 A
一种高效快速制备淫羊藿次苷II的酶解方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种高效快速的淫羊藿次苷II酶解制备方法，属于食品、保健品、化妆品与医药技术领域。
背景技术
[0002]淫羊藿是一种传统补益中药，其味辛、甘，性温，擅补肾阳、强筋骨、祛风湿，用于肾阳虚衰、
阳痿遗精、筋骨萎软、风湿痹痛、麻木拘挛等症。淫羊藿中黄酮类成分丰富，包括多种黄酮醇骨架的淫羊藿苷衍生物，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗衰老等广泛的药理活性，为代表其功效作用的有效成分。现行《中国药典》规定：在淫羊藿药材中，总黄酮含量以淫羊藿苷(C33H40O15)计应不得少于5.0％。其中，以淫羊藿苷含量最高，不低于0.5％。淫羊藿次苷II (IcarisidII，C27H30O10)是一种淫羊藿苷的天然单脱糖代谢物，亦称宝藿苷I(Icariside I)，化学结构式如下。
[0003]
[0004]研究发现，淫羊藿次苷II的药理活性普遍高于其他淫羊藿黄酮类成分，且安全性好，极具开发应用
前景。然而，其天然含量很低，在淫羊藿中仅～0.17mg/g，单纯提取分离难以满足需求，以来源丰富、易得的淫羊藿苷为原料制备淫羊藿次苷II的研究备受关注。由于淫羊藿苷分子结构中C7-糖苷键在酸性介质中的稳定性低于C3-糖苷键，且受空间阻碍使酶水解C3-糖苷键的活力极低，生物转化无疑是水解淫羊藿苷的C7-糖苷键获得7位羟基游离的淫羊藿次苷II的最佳方法。
[0005]生物转化包括微生物发酵法和酶法。有研究报道，将淫羊藿苷与大鼠肠菌液共孵育制备淫羊藿次苷II，但操作复杂、转化能力低、产物分离纯化困难的问题突出，不适于工业制备。酶转化法制备是利用酶作为催化剂实现化学转化的过程，是酶制剂对外源性底物进行结构性修饰所发生的化学反应，具有反应条件温和、选择性强、转化率高、流程短的优点，一般产物也便于提取分离，工艺研究控制方便，且环境友好、成本低廉，更有利于规模化制备。
[0006]酶及酶体系能将许多天然化合物转化为具有较高生物活性的物质，关键在于筛选廉价而高效专一、适用于制备的工业酶制剂，一般是具有酶解糖苷键的酶，如柚皮苷酶、果胶酶、纤维素酶、蜗牛酶以及乳糖酶等。针对以淫羊藿苷为原料酶解转化制备淫羊藿次苷II，近年来开展了相关研究。专利CN105925635A公开了一种由淫羊藿苷酶解制备淫羊藿次苷II的生产工艺，但其中的高催化活性葡聚糖酶需要专门筛选球菌进行培养制备，酶的成
本高，来源也受到限制。商品酶的应用受到更多关注，如β-葡萄糖糖苷酶、纤维素酶等(Fitoterapia 81(2
010)437-442；中草药41(2010):888-892；中药材35(2012):1148-1155；中成药42(2020):779-782)。然而，现有技术的酶解转化率较低，而且，这些方法在酶解过程中普遍需要在反应体系中加入增溶剂，同时配成低浓度溶液进行反应，从而导致酶解转化周期较长，转化效率低，不利于规模化生产。
发明内容
[0007]有鉴于此，本发明的目的在于提供一种以淫羊藿苷为原料，以来源丰富、价格低廉且酶解效能高的蜗牛酶进行水解转化，从而快速、高效、专一地制备具有更强生物活性的淫羊藿次苷II的方法。
[0008]一种高效快速制备淫羊藿次苷II的酶解方法，包括如下步骤，
[0009](1)底物溶液制备：取淫羊藿苷适量，加溶剂溶解，得底物溶液，所述溶剂为与水互溶的有机溶剂或其任意比例的含水溶剂体系，优选为含二甲基亚砜体积比不低于80％的水性缓冲溶液；
[0010](2)酶溶液制备：取蜗牛酶适量，加水性缓冲溶液溶解，得酶溶液，所述水性缓冲溶液pH值为4.5-7.0，优选为pH值5.0-6.0；
[0011](3)酶解反应：将步骤(2)得到的酶溶液加入到步骤(1)得到的底物溶液中，在水性缓冲溶液介质中进行酶解反应；所述酶解反应的蜗牛酶与底物淫羊藿苷重量比为(0.5-2.0)：1，优选为(0.8～1.0)：1；酶解反应温度控制为20℃～50℃，优选为30℃～40℃；酶解反应时间为0.5小时～12小时，优选为2小时～5
小时；在最终的酶解反应体系中，底物浓度不低于2mg/mL，并包含体积比不超过5％的与水互溶的有机溶剂，优选为可包含体积比不超过1％的二甲亚砜；
[0012](4)后处理与纯化：将步骤(3)得到的酶解反应产物采用常规方法进行进一步处理与纯化，得到所述的淫羊藿次苷II；所述常规处理与纯化方法为离心、过滤、柱层析、重结晶、溶剂萃取方法中的一种或几种。
[0013]与现有技术相比，本发明的创新在于以天然来源丰富的淫羊藿苷为原料，创新采用与水互溶且对其有高溶解度的DSMO对其进行溶解，首先制得有机溶剂DSMO量很低的高浓度淫羊藿苷底物溶液，再加入酶溶液进行酶解转化反应，与现有技术相比，能够实现在不影响酶活力的情况下，极大提升水难溶性底物淫羊藿苷在水性酶解体系与酶的接触机会，从而提高酶解转化效率，同时能够最大限度地减少有机溶剂使用；进一步的，特殊的酶解步骤起到了关键作用，本发明将酶溶液加到与水互溶的小体积的高浓度底物淫羊藿苷溶液中，在控制条件下于DSMO水性缓冲介质体系中进行酶解转化反应，能够在保证底物淫羊藿苷充分分散溶解与酶充分接触反应的同时，有效控制反应体系中与水互溶有机溶剂DSMO的量，使得生成的酶转化产物在反应体系中具有很低的溶解度而随反应进行不断析出促进转化平衡向产物生成方向移动，从而进一步提高酶解转化反应速度和效率。
[0014]与现有技术相比，本发明提供的方法具有如下优点，
[0015](1)淫羊藿苷在含二甲基亚砜体积比不低于80％的水性缓冲溶液具有良好的溶解度，制备制得溶液具有底物浓度高但有机溶剂量很低的优点，加入酶溶液于其中进行酶解转化反应，能够实现在不影响酶活力的情况下，极大提升水难溶性底物在水性酶解体系与
酶的接触机会，从而提高酶解转化效率；
[0016](2)将含酶的水性缓冲溶液加到与水互溶的小体积的高浓度底物溶液中，在控制条件下于水性缓冲介质体系中进行酶解转化反应，能够在保证底物充分分散溶解与酶充分接触反应的同时，有效控制反应体系中与水互溶有机溶剂的量，极大降低酶转化产物在反应体系中的溶解度，因而随反应进行不断析出，从而促进转化平衡向产物生成方向移动，进一步保证酶解转化反应速度和效率的提升；
[0017](3)本发明所述的蜗牛酶是由蜗牛嗉囊和消化道制备的一种混合酶，含有纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、蛋白酶等20多种酶，具有很强生物转化能力，且经济易得，在生物工程相关领域中应用广泛。与现有技术使用的大多数纯酶相比，蜗牛酶成本更低，且反应专属性较高，产物纯度高；
[0018](4)本发明提供的酶解转化工艺条件，无需添加任何表面活性剂，并能够最大限度地减少有机溶剂使用，实现环境友好，同时也极大方便了后处理纯化，易于放大和工业化，从整体上实现了节约资源和绿、高效生产。
[0019]本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。
具体实施方式
[0020]本发明的特点是利用对淫羊藿苷有强溶解特性的DSMO，制得小体积的高浓度底物溶液用于酶解转化，反应在控制DSMO含量的水性缓冲体系中进行在充分保证酶活力以及底物与酶接触反应效率的同时转化产物淫羊藿次苷II不断析出，从而在最大限度减少有机溶剂使用的情况下促进酶解转化效率和反应速度。
[0021]为了清楚，不描述实际实施例的全部特征。在下列描述中，不详细描述公知的功能和结构，因为它们会使本发明由于不必要的细节而混乱。应当认为在任何实际实施例的开发中，必须作出大量实施细节以实现开发者的特定目标。为了便于理解本发明，下面列举实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的范围并不受这些实例的任何限制。
[0022]本发明实施例中所使用的实验操作方法如无特殊说明，均为常规方法。除特殊说明外，本发明实施例所用的各种材料、试剂等均为市售的已知产品，其中，所选用的淫羊藿苷、淫羊藿次苷II对照品(纯度>98.0％)由上海茁采生物科技有限公司提供，蜗牛酶(> 300U/mg)由上海一研生物科技有限公司提供。
[0023]实施例1：
[0024]本实施例提供一种采用本发明方法酶解淫羊藿苷制备淫羊藿次苷II的优选方式，对本发明方法做进一步具体描述。
[0025](1)酶解转化反应：取淫羊藿苷500mg置三角烧瓶中，加1mL DSMO溶解得底物溶液，然后加入100mL含蜗牛酶500mg的水性缓冲溶液即醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 5.0)，充分混合均匀，置恒温气浴振荡器中，于(37±1)℃下反应2小时。HPLC分析监测显示，底物淫羊藿苷转化率为98.5％。
[0026](2)后处理纯化：反应液用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，先后用水和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压除溶剂至干，得黄绿粉末状固体，与淫羊藿次苷II对照品在相同条件下进行HPLC测定，谱保留时间一致。
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议