(10)申请公布号 CN 102559731 A
(43)申请公布日 2012.07.11C N 102559731 A
*CN102559731A*
(21)申请号 201110445022.5
(22)申请日 2011.12.27
C12N 15/70(2006.01)
C12N 15/66(2006.01)
C12Q 1/70(2006.01)
C12R 1/92(2006.01)(71)申请人中国检验检疫科学研究院
地址100123 北京市朝阳区高碑店北路甲3
号
(72)发明人吴绍强 邓俊花 林祥梅 王彩霞
(74)专利代理机构北京路浩知识产权代理有限
公司 11002
代理人王朋飞 王加岭
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种动物病原微生物假病毒载
分包含基因调节元件序列的5′非编码序列相应
的cDNA 序列连接到pTrcHis2A 载体启动子的下
游，构建了前假病毒载体。然后通过基因插入方
法，将MS2噬菌体中外壳蛋白的第15-16个氨基酸
之间加入6His 纯化标签，这样含外源基因的假病
毒颗粒表达后为RNA-蛋白质复合体，利用纯化蛋
白方法捕获假病毒颗粒，可以减化假病毒颗粒制
备的繁琐操作过程，同时提高假病毒颗粒纯化的
质量。本发明假病毒载体为pTrcMS ，其核苷酸序
列如SEQ ID No.1所示。
(51)Int.Cl.
权利要求书1页 说明书7页
序列表5页 附图2页
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书 1 页 说明书 7 页序列表 5 页 附图 2 页
1/1页
1.一种假病毒载体，其特征在于，包括出发载体的启动子序列和终止子序列，MS2噬菌体成熟酶蛋白基因编码序列、突变的外壳蛋白基因编码序列、部分裂解蛋白和复制酶基因编码序列，出发载体一个末端的多克隆位点序列。
2.如权利要求1所述的假病毒载体，其特征在于，所述的突变的外壳蛋白基因编码序列是在位于MS2噬菌
体的外壳蛋白基因编码序列的第15-16个氨基酸之间，插入6His 标签，核苷酸序列为CATCACCATCACCATCAC 。
3.如权利要求1或2所述的假病毒载体，所述的出发载体为pTrcHis2A 。
4.如权利要求3所述的假病毒载体，其为pTrcMS ，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
5.一种权利要求4所述假病毒载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)在pTrcHis 2A 载体多克隆位点的NcoI 和BglII 双酶切位点处插入噬菌体MS2的基因片段，得到前假病毒载体pTrcHis-MS2；
2)通过基因插入方法将载体pTrcHis-MS2中外壳蛋白基因编码序列的第15-16个氨基酸之间插入6His 序列，构建得到假病毒载体；
3)假病毒载体pTrcMS 用His 柱进行纯化。
6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述步骤2)是以前假病毒载体pTrcHis-MS2为模板，以两对含有突变基因的PCR 引物对为引物，分别进行PCR 扩增反应，回收纯化扩增产物；用XhoI 和Hind III 双酶切前假病毒载体pTrcHis-MS2；两次PCR 的扩增产物与酶切后的pTrcHis-MS2连接，转化受体菌，经筛选，诱导表达，鉴定得到假病毒载体pTrcMS 。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的含有突变基因的PCR 引物对，其核苷酸序列为：
Primer1-F ：5’-AGGTAACATGCTCGAGGGCCTT-3’，
Primer1-R ：5’-GACATCACCATCACCATCACACTGGCGACGTGGCTGTCGCCCCA-3’；
Primer2-F ：5’-GTGTGATGGTGATGGTGATGTCCGCCATTGTCGACGAGAACG-3’，
Primer2-R ：5’-GTTCGGGCCCAAGCTTCGAATTCCC-3’。
8.一种假病毒颗粒，其特征在于，含有权利要求4所述假病毒载体pTrcMS 及其携带有外源基因的噬菌体基因组。
9.一种假病毒颗粒的制备方法，其特征在于，将外源基因克隆于权利要求4所述假病毒载体pTrcMS 中的MS2噬菌体外壳蛋白基因编码序列下游，在其下游插入终止子，转录后得到带有噬菌体操纵子RNA 序列的外源基因RNA 转录本，诱导表达噬菌体外壳蛋白并组装成蛋白外壳，并将携带有外源基因的噬菌体基因组包裹到包膜内，得到假病毒颗粒。
10.权利要求4所述的假病毒载体或权利要求8所述的假病毒颗粒在制备检测动物病原微生物质控品的应用。权 利 要 求 书CN 102559731 A
一种假病毒载体及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及基因工程领域，涉及一种动物病原微生物假病毒载体的制备方法及其应用。
背景技术
[0002] 二十世纪末，Pasloske等人提出了一种新的RNA质控品制备技术，即装甲RNA(Armored RNA)技术(Pasloske B L，et al.Armored RNAtechnology for production of ribonuclease-resistant viral RNA controls and standards[J].J Clin Microbiol，1998，36(12)：3590-3594；W alker Peach C R，et al.Ribonuclease resistant RNA controls(Armored RNA)for reverse transcription-PCR，branched DNA，and genotyping assays for hepatitis C virus[J].Clin Chem，1999，45(12)：2079-2085)。该技术解决了传统RNA质控品存在的问题(或者稳定性差，或存在生物传染隐患，或达不到监测核酸提取及反转录过程的目的等)。装甲RNA技术的原理是将包含有大肠杆菌MS2噬菌体的外壳蛋白基因的序列及外源基因克隆到表达载体中，这一载体能够将外源基因转录成RNA，并利用载体上MS2的外壳蛋白编码基因组装的外壳蛋白将其装配成球状RNA病毒结构的RNA-蛋白质复合体，我们称之为装甲RNA假病毒颗粒。
[0003] 目前构建假病毒颗粒的常用假病毒载体主要由可以编码MS2噬菌体外壳蛋白的基因序列和具有高效表达的表达载体组成。MS2噬菌体是单链正性RNA病毒，为26nm长的20面体，包含有3个基因，编码成熟酶蛋白、外壳蛋白、复制酶蛋白和裂解蛋白4种蛋白质分子。噬菌体由180个外壳蛋白单体、一分子成熟酶蛋白和一分子基因组RNA组成。每个MS2噬菌体是含有180个拷贝的外壳蛋白，一拷贝的成熟酶蛋白，包裹一分子RNA的正二十面体(贾盘兴.噬菌体分子生物学-基木知识和技能[M].北京：科学出版社，2001，2-5)。在早期噬菌体的研究中发现，噬菌体复制酶基因的5’端有一个约21个核苷酸组成的茎-环区域(操纵子或pac位点)，噬菌体外壳蛋白的二聚体与这个茎环结构的结合不但引发了外壳蛋白本身的组装，而且还引发了外壳蛋白包裹整个噬菌体基因组RNA的过程(Peabody DS.The RNAbinding site of bacteriophage MS2 coat protein.EMBO J，1993，12(2)：595-600；Peabody DS.Role of the coat protein-RNA interaction in the life cycle of bacteriophage MS2.Mol Gen Genet，1997，254(4)：358-364)。MS2噬菌体成熟酶蛋白可与噬菌体RNA的两个位点发生作用。这种相互作用不是噬菌体包装过程所必须的，但是在噬菌体颗粒中这种相互作用可以用来保护基因组RNA不被广泛存在的核糖核酸酶消化(Shiba T，Suzuki Y.Localization of A protein in the RNA-Aprotein complex of RNA phage MS2.Biochim Biophys Acta.1981，654(2)：249-255.)研究表明MS2噬菌体成熟酶蛋白对噬菌体外壳的包装起重要作用(Kuzmanovic DA，Elashvili l，Wick C，et al.The MS2Coat Protein Shell is Likely assembled Under Tension：a novel role for the MS2 Bacteriophage A Protein as revealed by small-angle neutron scattering[J]. J Mol Biol，2006，355(5)：1095-1111)。裂解蛋白和复制酶蛋白不是噬菌体颗粒的组成部
分。裂解蛋白的作用是裂解大肠杆菌细胞从而释放出病毒颗粒。复制酶蛋白的作用是与其它3个大肠杆菌宿主蛋白组成一个蛋白复合体，这个蛋白复合体负责基因组RNA的复制和合成。在MS2噬菌体外壳蛋白的研究中发现外壳蛋白与噬菌体复制酶5′端由19个碱基(19mer)组成的茎环结构RNA序列有特异性相互作用，这种作用可引发噬菌体外壳的组装，同时又将噬菌体基因组RNA包装到包膜内。研究人员发现在包装位点后引入非噬菌体基因序列也可以引发包装。因此，如果将外源基因克隆于MS2噬菌体外壳蛋白基因编码序列下游，并在其下游插入终止子，转录后得到带有噬菌体操纵子RNA序列的外源基因RNA转录本，诱导表达过程中噬菌体外壳蛋白得以表达并组装成蛋白外壳，并将携带有外源基因的噬菌体基因组包裹到包膜内，构成噬菌体病毒样颗粒。由于单独表达的外壳蛋白组装过程不成熟，不能得到耐RNase的病毒包膜，研究者将MS2噬菌体的成熟酶蛋白和外壳蛋白的基因编码序列以及其基因组部分包含基因调节元件序列的5′非编码序列相应的cDNA序列都连接到表达载体启动子下游，经过诱导表达得到成熟酶蛋白和外壳蛋白，在成熟酶以及噬菌体基因组RNA的协同作用下，外壳蛋白可组装为成熟的假病毒颗粒外壳，并具有耐RNase作用的特性。
[0004] 在假病毒颗粒制备技术中，目前存在的最大问题是纯化问题以及含有假病毒颗粒溶液的纯度问题。传统方法一般如下操作：含有外源基因的重组体成功构建后进行诱导表达，然后破碎细胞，双酶(DNaseI和RNase A)消化，再按照噬菌体纯化方法进行纯化：盐沉淀，梯度离心回收假病毒颗粒。这种方法操作繁琐，对设备要求高(需要高速低温离心机)，更关键的是：梯度离心回收的含有假病毒颗粒的
溶液中仍然存在一定量的核酸，并且残余核酸在PCR鉴定含有假病毒颗粒溶液的纯度过程中很容易使PCR产生假阳性，更进一步影响到假病毒颗粒定量的研究。虽然有些研究人员在纯化的含有假病毒颗粒溶液提取RNA 后，再进行DNase I酶消化，以去除残存核酸干扰，但这样会造成制备的RNA损失很大，同样造成下一步定量不精确。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供一种假病毒载体pTrcMS。
[0006] 本发明的另一目的是提供制备假病毒载体pTrcMS的方法和应用。
[0007] 所述的假病毒载体包括出发载体的启动子序列和终止子序列，MS2噬菌体(NC_001417)成熟酶蛋白基因编码序列、突变的外壳蛋白基因编码序列、部分裂解蛋白和复制酶基因编码序列，出发载体一个末端的多克隆位点序列。
[0008] 其中，突变的外壳蛋白基因编码序列是在位于MS2噬菌体的外壳蛋白基因编码序列的第15-16个氨基酸之间，插入6His标签(CATCACCATCACCATCAC)得到的。
[0009] 所述的出发载体为pTrcHis2A载体。
[0010] 本发明提供的假病毒载体为pTrcMS，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。假病毒载体pTrcMS结构图见图1。
[0011] 本发明提供了一种假病毒载体pTrcMS的构建方法，包括以下步骤：
[0012] 1)在pTrcHis 2A载体多克隆位点的NcoI和BglII双酶切位点处插入噬菌体MS2的成熟酶蛋白、外壳蛋白、部分裂解蛋白和复制酶的基因编码序列，得到前假病毒载体pTrcHis-MS2；
[0013] 2)通过基因插入方法将载体pTrcHis-MS2中外壳蛋白的第15-16个氨基酸之间插入6His序列，构建得到假病毒载体；
[0014] 3)假病毒载体pTrcMS用His柱进行纯化。
[0015] 具体地，上述步骤2)是以步骤1)获得的前假病毒载体pTrcHis-MS2为模板，以两对含有突变基因的PCR引物对为引物，分别进行PCR扩增反应，50ul PCR扩增的反应体系
为：5×STAR Buffer(Mg2+ plus)10ul，STAR HS DNAPolymerase 1.3U，dNTP Mixture(各2.5mM)4ul，
primer1(10pmol/ul)1ul，primer2(10pmol/ul)1ul，pTrcHis-MS2 O至50ul。PCR扩增的循环程序为：98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延DNA 10ng，补ddH
2
伸30s，30个循环，72℃延伸10min，回收纯化扩增产物；
[0016] 用XhoI和Hind III双酶切前假病毒载体pTrcHis-MS2；采用In-
HD Cloning Kit将两次PCR的扩增产物与酶切后的pTrcHis-MS2连接，转化受体菌，摇菌、PCR鉴定(Primer-U1：5’-GACAATTAATCATCCGGCTCG-3’，Primer-L1：5’-GATCTTCGTTTAGGGCAAGGTAG-3’)，获得阳性质粒pTrcMS；pTrcMS重组菌采用IPTG诱导表达，离心收集菌体。沉淀中加入细胞裂解液Fast Break TM CellLysis Reagent(10×)破碎细胞，离心收集上清，采用MagneHis TM Protein Purification System纯化蛋白方式回收产物，得到假病毒载体pTrcMS。
[0017] 本发明提供了含有突变基因的PCR引物对，其核苷酸序列为：
[0018] Primer1-F：5’-AGGTAACATGCTCGAGGGCCTT-3’，
[0019] Primer1-R：5’-GACATCACCATCACCATCACACTGGCGACGTGGCTGTCGCCCCA-3’；[0020] Primer2-F：5’-GTGTGATGGTGATGGTGATGTCCGCCATTGTCGACGAGAACG-3’，
[0021] Primer2-R：5’-GTTCGGGCCCAAGCTTCGAATTCCC-3’。
[0022] 本发明提供了一种假病毒载体的构建方法，包括以下步骤：
[0023] 1)在pTrcHis 2A载体多克隆位点的NcoI和BglII双酶切位点处插入噬菌体MS2的成熟酶蛋白、外壳蛋白、部分裂解蛋白和复制酶的基因片段，得到前假病毒载体pTrcHis-MS2；
[0024] 2)通过基因插入方法将载体pTrcHis-MS2中外壳蛋白的第15-16个氨基酸之间插入6His序列，具体是以步骤1)获得的前假病毒载体pTrcHis-MS2为模板，以两对含有突变基因的PCR引物对为引物，其核苷酸序列为：
[0025] Primer1-F：5’-AGGTAACATGCTCGAGGGCCTT-3’，
[0026] Primer1-R：5’-GACATCACCATCACCATCACACTGGCGACGTGGCTGTCGCCCCA-3’；[0027] Primer2-F：5’-GTGTGATGGTGATGGTGATGTCCGCCATTGTCGACGAGAACG-3’，
[0028] Primer2-R：5’-GTTCGGGCCCAAGCTTCGAATTCCC-3’；
[0029] 分别进行PCR扩增反应，50ul PCR扩增的反应体系为：5×STAR
Buffer(Mg2+plus)10ul，STAR HS DNA Polymerase1.3U，dNTP Mixture(各2.5mM)4ul，primer1(10pmol/ul)1ul，primer2(10pmol/ul)1ul，pTrcHis-MS2DNA 10ng，补
O至50ul。PCR扩增的循环程序为：98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸30s，30个循ddH
2
环，72℃延伸10min，回收纯化扩增产物；
[0030] 用XhoI和Hind III双酶切前假病毒载体pTrcHis-MS2；采用In-
HD Cloning Kit将两次PCR的扩增产物与酶切后的pTrcHis-MS2连接，转化受体菌，摇
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