[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公布说明书
[11]公开号CN 1891831A [43]公开日2007年1月10日
[21]申请号200510040858.1[22]申请日2005.07.01
[21]申请号200510040858.1
[71]申请人南京理工大学
地址210094江苏省南京市孝陵卫200号
[72]发明人杨树林 宁长发 沈薇 陆晓 唐仕荣 孟
广荣 高力虎 [74]专利代理机构南京理工大学专利中心代理人朱显国
[51]Int.CI.C12P 19/02 (2006.01)
权利要求书 2 页 说明书 7 页 附图 2 页
[54]发明名称
[57]摘要
本发明公开了一种鼠李糖脂的制备方法。它包
样品浸泡预处理后接入增殖培养基，划线法接种于
血液琼脂平板上培养，挑取单菌落，并接种于蓝
琼脂平板上培养，挑取出现蓝晕圈的菌落接入斜
后测定其排油活性、乳化性能及发酵液表面张力，
然后选取目的菌株；发酵工艺优化，将经筛选的菌
发酵条件优化、菌种优化得到鼠李糖脂发酵液；对
鼠李糖脂发酵液进行提取得到鼠李糖脂粗产品。本
发明具有所筛选菌株的产量高、重烃降解效果明显、
克服仅依靠生物表面活性剂溶血性进行判断的缺点、
提高了筛选准确度等显著优点。
200510040858.1权 利 要 求 书第1/2页 1、一种鼠李糖脂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1.1在25～35℃的环境温度下菌种的筛选：对取自油田污水或油泥的样品浸泡预处理后接入增殖培养基培养22～24小时，经增殖培养的培养液采用划线法接种于血液琼脂平板上培养24～72小时，挑取溶血圈的单菌落，并接种于蓝琼脂平板上培养24～120小时，挑取出现蓝晕圈的菌落接入斜面作菌种保藏；将保藏在斜面培养基中的初筛菌株接入发酵培养基中发酵72～120小时后测定其排油活性、乳化性能及发酵液表面张力，然后选取目的菌株，并存种；
1.2发酵工艺的优化：将经筛选选取的菌株进行发酵，在发酵过程中首先进行发酵培养基优化，对发酵过程的碳源、氮源、无机盐及各基质用量进行优化选择，通过考察菌株在各条件下的鼠李糖脂产量、发酵液表面张力变化、发酵周期长短、发酵成本和发酵过程控制难易度确定最优发酵培养基；其次，进行发酵条件优化，对发酵温度在20～50℃、pH＝3～11、溶解氧、搅拌速度和生物反应器装液量以及种子培
养、接种量1％～10％的条件进行优化；最后进行菌种优化得到鼠李糖脂发酵液；
1.3对鼠李糖脂发酵液的提取：将发酵液经离心除菌体后，过滤除去不溶性杂质和剩余液蜡，溶液pH＝6.0～6.5，加入萃取溶剂，搅拌、萃取分液，合并有机相，用等体积水洗，用旋转蒸发仪减压蒸除溶剂，得到鼠李糖脂粗样品。
2、根据权利要求1所述的鼠李糖脂的制备方法，其特征在于将经筛选选取的菌株接入到液化甘油为唯一碳源中进行发酵工艺优化。
3、根据权利要求1或2所述的鼠李糖脂的制备方法，其特征在于对鼠李糖脂粗样品进行柱层析纯化：首先用湿法装柱，用氯仿将鼠李糖脂粗样品溶解，然后缓慢加入溶于氯仿中的硅胶，边加入边轻振动硅胶柱，硅胶柱装好后加盖砂芯，并用氯仿进行平衡；然后慢而连续地上样，用氯仿冲洗至带出现，用氯仿/甲醇展开，从底部放出液体，直到黄带完全展开开始向下移动到接近柱底部；再用氯仿洗脱，从黄带开始，收集从下方被洗脱出来的物质，蒸去溶剂；重复上述的柱层析纯化过程，获取较纯的鼠李糖脂样品。
200510040858.1权 利 要 求 书 第2/2页 4、根据权利要求3所述的鼠李糖脂的制备方法，其特征在于对较纯的鼠李糖脂样品进一步纯化：将较纯的鼠李糖脂样品用少量水溶解，以氯仿/甲醇萃取，减压蒸除溶剂后，用丙酮将产物再溶解，减压浓缩，进行重结晶。
200510040858.1说 明 书第1/7页
一种鼠李糖脂的制备方法
一、技术领域
本发明公开了一种糖脂类生物表面活性剂的制备方法，特别是一种鼠李糖脂的制备方法。
二、背景技术
鼠李糖脂属于一种糖脂类生物表面活性剂，除具有降低表面张力、稳定乳化液和增加泡沫等作用外，还具有一般化学合成表面活性剂所不具备的无毒、能生物降解等优点。因此，可广泛应用于工业、农业、医药及日常生活的各个领域，尤其适合于石油工业和环境工程领域，如石油的生物降粘、提高原油采收率、重油污染土壤的生物修复等。另外，作为天然添加剂，鼠李糖脂在食品工业、精细化工、医药和农业等工业方面也愈来愈受到人们的青睐。
现有技术中，已有采用微生物法合成鼠李糖脂的报道。在鼠李糖脂的制备过程中，菌种的筛选最为重要，目前广泛使用的方法是血液琼脂平板法，它通过对原样中产生菌的培养，使血液琼脂培养基中的红细胞发生溶血现象，再通过比较菌落周围形成的溶血圈直径的大小进行快速筛选，得到可以制备高产量鼠李糖脂的优质菌种，然后将优质菌种在不同的时间内接入含不同碳源的发酵培养基内，以促进菌体的
代谢，从而得到鼠李糖脂。B i o t e c h n o l.P r o g.2002，18，1277～1281“R h a m n o l i p i d Biosurfactant Production by Strains of Pseudomonas aeruginosa Using Low-Cost Raw Materials”公开了一种鼠李糖脂的制备方法，它是在汽油、柴油污染的土壤中，通过血液琼脂平板的稀释涂布方法，筛选产生鼠李糖脂的产生菌，得到以原油为唯一碳源生长的两株优质菌株，并进一步分析得出DS10-129菌株为制备鼠李糖脂的高产菌。在以DS10-129菌株为产生菌生产鼠李糖脂的过程中，要在不同的时间内接入含不同碳源的培养基进行发酵培养，约培养288小时后，可得到4.31g/L的高产量鼠李糖脂。上述制备鼠李糖脂的方法存在有以下不足：1、采用血液琼脂平板的稀释涂布方法进行产鼠李糖脂菌株筛选，虽然可直观的看到溶血圈的产生，但溶血圈不规则，血液中的
200510040858.1说 明 书 第2/7页一些成份或杂菌常常也会产生类似的溶血圈，实际操作中很难通过溶血圈的大小判断产表面活性剂的多少，而且在培养过程中，血液中的一些成份或杂菌常常也会产生类似的溶血圈，对培养基的配制和使用过程造成杂菌污染；2、这种筛选方法在稀释涂布时工作量大，以原油为唯一碳源时菌株的生长缓慢，因而造成筛选的周期较长；3、该方法在发酵培养过程中需要使用不同的碳源，即需要补料，因此增加了操作工序，同时该菌株的产量仍然过低，不利于工业化应用。
三、发明内容
本发明的目的在于提供一种菌种筛选工艺简单、质量好、发酵周期短、得产率高且生产成本低的鼠李糖脂的制备方法。
实现本发明目的的技术方案为：一种鼠李糖脂的制备方法，包括以下步骤： 1.1在25～35℃的环境温度下菌种的筛选：对取自油田污水或油泥的样品浸泡预处理后接入增殖培养基培养22～24小时，经增殖培养的培养液采用划线法接种于血液琼脂平板上培养24～72小时，挑取溶血圈的单菌落，并接种于蓝琼脂平板上培养24～120小时，挑取出现蓝晕圈的菌落接入斜面作菌种保藏；将保藏在斜面培养基中的初筛菌株接入发酵培养基中发酵72～120小时后测定其排油活性、乳化性能及发酵液表面张力，然后选取目的菌株，并存种；
1.2发酵工艺的优化：将经筛选选取的菌株进行发酵，在发酵过程中首先进行发酵培养基优化，对发酵过程的碳源、氮源、无机盐及各基质用量进行优化选择，通过考察菌株在各条件下的鼠李糖脂产量、发酵液表面张力变化、发酵周期长短、发酵成本和发酵过程控制难易度确定最优发酵培养基；其次，进行发酵条件优化，对发酵温度在20～50℃、pH值为3～11、溶解氧、搅拌速度和生物反应器装液量以及种子培养、接种量1％～10％的条件进行优化；最后进行菌种优化得到鼠李糖脂发酵液；
1.3对鼠李糖脂发酵液的提取：将发酵液经离心除菌体后，过滤除去不溶性杂质和剩余液蜡，溶液pH＝6.0～6.5，加入萃取溶剂，搅拌、萃取分液，合并有机相，用等体积水洗，用旋转蒸发仪减压蒸除溶剂，得到鼠李糖脂粗样品。
本发明鼠李糖脂的制备方法中，将经筛选选取的菌株接入到液化甘油为唯一碳源
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