(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711398252.4
(22)申请日 2017.12.22
(66)本国优先权数据
201710814146.3 2017.09.11 CN
(71)申请人 杭州百迈生物股份有限公司
地址 311228 浙江省杭州市大江东产业集
聚区临江高新区纬五路3688号科创园
2幢四层
(72)发明人 林源吉 丁佳女 郑宜文
(51)Int.Cl.
C12Q 1/6895(2018.01)
C12N 15/11(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种用于鉴定东北红豆杉的
SNP分子标记，所述SNP分子标记位于SEQ ID
NO.1所示序列的第444位碱基，
若第444位的碱基为T，则鉴定为东北红豆杉。本发明基于SNP分子
标记建立起了快速鉴定东北红豆杉的体系。从而
达到快速、准确检测东北红豆杉的目的，对于口
权利要求书2页 说明书8页序列表2页 附图6页CN 109486982 A 2019.03.19
C N 109486982
A
1.用于鉴定东北红豆杉的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记位于SEQ ID NO.1所示序列的第444位碱基，若第444位的碱基为T，则鉴定为东北红豆杉。
2.权利要求1所述SNP分子标记在东北红豆杉鉴定中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，从南方红豆杉、曼地亚红豆杉、欧洲红豆杉、西藏红豆杉、东北红豆杉和云南红豆杉中鉴定出东北红豆杉。
4.用于鉴定东北红豆杉的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列包括SEQ ID NO.1，或者SEQ ID NO.1所对应的cDNA或mRNA，所述SEQ ID NO.1序列的第444位的碱基为T。
5.一种鉴定东北红豆杉的试剂盒，其特征在于，包括用于特异性检测SEQ ID NO.1序列第444位的碱基为T存在与否的一种或多种引物，或引物和探针的组合。 6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述引物和探针选自：用于测序检测的特异性扩增引物和测序引物，引物序列分别为：
上游引物F1：5'-GCAGAGACTCAACGGAAGAT-3'，
下游引物R1：5'-CCCTATTTATCATCCAAGCG-3'，
测序引物：5'-GCAGAGACTCAACGGAAGAT-3'；
或者，用于荧光定量PCR检测的特异性扩增引物和探针，引物和探针序列分别为：
上游引物F2：5'-AGGTTGATCGTAAGATCAACTCATAT-3'
下游引物R2：5'-AATTGTATGTATAATACAATTATAC-3'
探针P2：5'-TTATAATAGAAATTTATAATGGTAACTT-3'；
或者，用于ARMS-PCR检测的特异性扩增引物，引物序列为：
上游引物F3：5'-AGGTTGATCGTAAGATCAACTCACAT-3'
下游引物R3：5'-CAGAACCTGAGCTCAGGTCAACT-3'。
7.根据权利要求5至6之一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于从南方红豆杉、曼地亚红豆杉、欧洲红豆杉、西藏红豆杉、东北红豆杉和云南红豆杉中鉴定出东北红豆杉。
8.一种制备鉴定东北红豆杉试剂盒的方法，包括制备检测反应试剂的步骤，其特征在于，所述反应试剂包含用于特异性检测SEQ ID NO.1序列第444位的碱基为T存在与否的一种或多种引物，或引物和探针的
组合。
9.用于鉴定东北红豆杉的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸用于特异性检测SEQ ID NO.1序列第444位的碱基为T存在与否，所述寡核苷酸选自用于测序的特异性扩增引物序列和测序引物序列，分别为
上游引物F1：5'-GCAGAGACTCAACGGAAGAT-3'，
下游引物R1：5'-CCCTATTTATCATCCAAGCG-3'，
测序引物：5'-GCAGAGACTCAACGGAAGAT-3'；
或者，用于荧光定量PCR扩增特异性上游引物F2序列、下游引物R2序列和探针P2序列，分别为：
上游引物F2：5'-AGGTTGATCGTAAGATCAACTCATAT-3'
下游引物R2：5'-AATTGTATGTATAATACAATTATAC-3'
探针P2：5'-TTATAATAGAAATTTATAATGGTAACTT-3'；
或者，进行ARMS-PCR扩增的特异性上游引物F3序列和下游引物R3序列，分别为：
上游引物F3：5'-AGGTTGATCGTAAGATCAACTCACAT-3'
下游引物R3：5'-CAGAACCTGAGCTCAGGTCAACT-3'。
10.一种鉴定东北红豆杉的方法，包括以下步骤：
(1)提取待测植物的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，检测SEQ IDNO.1序列第444位的碱基为T存在与否；
(3)若经检测，SNP位点为T时，则判断该待测植物鉴定为东北红豆杉。
用于鉴定东北红豆杉的SNP分子标记及应用
技术领域
[0001]本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及用于东北红豆杉的SNP分子标记及其应用。
背景技术
[0002]东北红豆杉(学名：Ta xus cus pida Z.)，又名紫杉。为红豆杉科(Taxaceae))乔木植物，是第三纪孑遗的珍贵树种。其材质优良，纹理通直，结构致密，富弹性，力学强度高，具光泽，有香气，
耐腐朽，不易开裂反翘，不含松脂，边材幅狭黄白，心材紫赤褐(紫杉因此而得名)。该种不仅是材用植物，也是重要的药用植物，其茎、枝、叶、根可入药，主要成分含紫杉醇、紫杉碱、双萜类化合物。具有抗癌功能，并有抑制糖尿病及心脏病的作用。东北红豆杉除有极高的药用价值外，尚有极佳的观赏价值，这是其它品种的红豆杉所无法企及的另一大优势。东北红豆杉侧枝多，红枝绿叶，株形娇美，所结红豆艳丽多姿，酷似南方的"相思豆"。因而用于制作珍稀观赏盆景，也可用于制作园林风景树。[0003]红豆杉有"植物活化石"和"国宝"之称。从中提取的紫杉醇是世界公认的抗癌药物，每公斤市场价在一千万美元以上，是世界上濒临灭绝的天然珍稀抗癌植物，属国家一级保护植物，至今已有250万年的历史。由于它的根、茎、叶、皮及种子含有紫杉醇，所以价格相当昂贵，不少国家将其列为"国宝"。美国、英国、俄罗斯、韩国和中国对紫杉进行多年研究，将紫杉醇从紫杉中提炼出来，用于临床癌症。经验证明，紫杉醇具有独特的抗肿瘤机制和显著的抑制肿瘤的作用，被专家和学者确认为本世纪初国际上最有开发前途的抗癌药物。
[0004]东北红豆杉不仅是珍稀的药用植物也是园林、庭院绿化、美化的佳品，是目前最珍贵稀有的高档绿化树种。具有独特的盆景观赏价值是东北红豆杉的又一大特，应用矮化技术处理的东北红豆杉盆景造型古朴典雅，枝叶紧凑而不密集，舒展而不松散，红茎、红枝、绿叶、红豆使其具有观茎、观枝、观叶、观果的多重观赏价值。光滑的红茎代表坦荡与高贵，常绿的针叶表达坚毅与永恒，酷似"相思豆"的红豆彰现了爱心与思念。整株造型含而不露，超凡脱俗，具有浓厚的生活气息和文化底蕴。东北红豆杉因其资源稀少，被列为中国一级珍稀树种加以保护。
[0005]形态学鉴定是东北红豆杉鉴定中常采用的方法，但形状特征易受生境、气候、生理状况等的影响而常常导致主观辨别上的偏差，仅靠形态差异难以准确鉴定。
[0006]近年来，利用分子生物学技术进行物种鉴定已经在一些珍惜物种及检验检疫方面得到了应用，如何利用分子生物学技术建立高效、快速、灵敏且准确度高的鉴定方法将是东北红豆杉鉴定领域的关键技术之一。
发明内容
[0007]本发明提供了一种用于鉴定东北红豆杉的SNP分子标记，所述SNP分子标记位于SEQ ID NO.1所示序列的第444位碱基，若第444位的碱基为T，则鉴定为东北红豆杉。
[0008]上述SNP分子标记在东北红豆杉鉴定中的应用。
[0009]进一步的，从南方红豆杉、曼地亚红豆杉、欧洲红豆杉、西藏红豆杉、东北红豆杉和云南红豆杉中鉴定出东北红豆杉。
[0010]本发明提供了一种用于鉴定东北红豆杉的核苷酸序列，包括SEQ ID NO.1，或者SEQ ID NO.1所对应的cDNA或mRNA，所述SEQ ID NO.1序列的第444位的碱基为T。[0011]本发明提供了一种鉴定东北红豆杉的试剂盒，包括用于特异性检测SEQ ID NO.1序列第444位的碱基为T存在与否的一种或多种引
物，或引物和探针的组合。
[0012]进一步的，所述引物和探针选自：
[0013]用于测序检测的特异性扩增引物和测序引物，引物序列分别为：
[0014]上游引物F1：5'-GCAGAGACTCAACGGAAGAT-3'，
[0015]下游引物R1：5'-CCCTATTTATCATCCAAGCG-3'，
[0016]测序引物：5'-GCAGAGACTCAACGGAAGAT-3'；
[0017]或者，用于荧光定量PCR检测的特异性扩增引物和探针，引物和探针序列分别为：[0018]上游引物F2：5'-AGGTTGATCGTAAGATCAACTCATAT-3'
[0019]下游引物R2：5'-AATTGTATGTATAATACAATTATAC-3'
[0020]探针P2：5'-TTATAATAGAAATTTATAATGGTAACTT-3'；
[0021]或者，用于ARMS-PCR检测的特异性扩增引物，引物序列为：
[0022]上游引物F3：5'-AGGTTGATCGTAAGATCAACTCACAT-3'
[0023]下游引物R3：5'-CAGAACCTGAGCTCAGGTCAACT-3'。
[0024]进一步的，所述试剂盒用于从南方红豆杉、曼地亚红豆杉、欧洲红豆杉、西藏红豆杉、东北红豆杉和云南红豆杉中鉴定出东北红豆杉。
[0025]所述的试剂盒还包括阳性质控品和阴性质控品。
[0026]本发明提供了一种制备鉴定东北红豆杉试剂盒的方法，包括制备检测反应试剂的步骤，所述反应试剂包含用于特异性检测SEQ ID NO.1序列第444位的碱基为T存在与否的一种或多种引物，或引物和探针的组合。
[0027]本发明还提供了一种用于鉴定东北红豆杉的寡核苷酸，其用于特异性检测SEQ ID NO.1序列第444位的碱基为T存在与否，所述寡核苷酸选自：
[0028]用于测序的特异性扩增引物序列和测序引物序列，分别为
[0029]上游引物F1：5'-GCAGAGACTCAACGGAAGAT-3'，
[0030]下游引物R1：5'-CCCTATTTATCATCCAAGCG-3'，
[0031]测序引物：5'-GCAGAGACTCAACGGAAGAT-3'；
[0032]或者，用于荧光定量PCR扩增特异性上游引物F2序列、下游引物R2序列和探针P2序列，分别为：
[0033]上游引物F2：5'-AGGTTGATCGTAAGATCAACTCATAT-3'
[0034]下游引物R2：5'-AATTGTATGTATAATACAATTATAC-3'
[0035]探针P2：5'-TTATAATAGAAATTTATAATGGTAACTT-3'；
[0036]或者，进行ARMS-PCR扩增的特异性上游引物F3序列和下游引物R3序列，分别为：[0037]上游引物F3：5'-AGGTTGATCGTAAGATCAACTCACAT-3'
[0038]下游引物R3：5'-CAGAACCTGAGCTCAGGTCAACT-3'。
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