(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810160407.9
(22)申请日 2018.02.27
(71)申请人 温州医科大学
地址 325000 浙江省温州市瓯海区东方南
路38号温州市国家大学科技园孵化器
(72)发明人 谭国强 庞一林 吕建新 李江辉
杜璟 李唐
(74)专利代理机构 温州匠心专利代理事务所
(特殊普通合伙) 33279
代理人 胡仁勇
(51)Int.Cl.
C12N 15/70(2006.01)
C12N 15/66(2006.01)
(54)发明名称
法及其应用
(57)摘要
本发明涉及一种基于无缝克隆技术的基因
如下：根据突变位点处的序列分别设计5′端包含
点可位于同源臂中任一位置；在质粒的非突变位
点区分别设计5′端包含另一互补同源臂的正向
和反向引物，PCR扩增出的两个一端包含突变位
点的片段，需存在500bp以上的大小差异；对于多
位点突变，根据突变位点数设计出与位点数相同
对数的突变引物；采用同源重组酶将2-5个片段
一步无缝拼接，构建具有目标突变位点的环状质
粒。所述方法相对经典的重叠延伸PCR法，具有快
速简便，可对小于40kb质粒任意位置实现单点或
多点、连续或不连续突变，突变效率达100％的特
点。
权利要求书1页 说明书23页序列表7页 附图6页CN 108486139 A 2018.09.04
C N 108486139
A
1.一种基于无缝克隆技术的基因定点突变方法，其特征在于：通过设计两对引物扩增构建单位点突变质粒，其中一对引物是根据突变位点处的序列分别设计5′端包含互补同源臂序列的正向突变引物和反向突变引物，突变位点可位于同源臂中任一位置；另一对引物是在质粒的非突变位点区分别设计5′端包含另一互补同源臂的正向引物和反向引物，引物中同源臂大小为15-20bp；然后采用无缝克隆技术，将高保真酶扩增出的两个一端包含突变位点的片段进行无缝拼接，构建具有目标突变位点的环状质粒。
2.根据权利要求1所述的基于无缝克隆技术的基因定点突变方法，其特征在于：PCR扩增出的两个一端包含突变位点的片段，存在500bp以上的大小差异时，可确保无缝克隆的高效性。
3.根据权利要求1所述的基于无缝克隆技术的基因定点突变方法，其特征在于：对于多位点突变，要根据突变位点数设计出与位点数相同对数的5′端包含互补同源臂序列的突变引物，采用同源重组酶可将2-5个片段一步无缝拼接，构建具有多个突变位点的环状质粒。
4.根据权利要求1所述的基于无缝克隆技术的基因定点突变方法，其特征在于：PCR扩增质粒模板后，采用Dpn I酶体外降解甲基化的非突变型质粒模板；将利用无缝克隆技术构建的含目标突变位点的环状质粒转化到DMT感受态细胞中，DMT感受态细胞体内降解甲基化的非突变型质粒模板，从而有效筛选突变克隆。
5.一种基于无缝克隆技术的基因定点突变试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括包装盒、衬垫、试剂管和使用说明书，其组成成分包括：一、高保真DNA聚合酶预混液；二、Dpn I和10×Dpn I buffer；(3)无缝克隆酶和5×无缝克隆缓冲液；(4)DMT感受态细胞；(5)对照质粒和对照质粒的通用鉴定引物；(6)无菌ddH 2O。
6.一种基于无缝克隆技术的基因定点突变方法与试剂盒在分子生物学、遗传学与蛋白质工程等研究领域中的应用。
权 利 要 求 书1/1页CN 108486139 A
一种基于无缝克隆技术的基因定点突变方法及其应用
技术领域
[0001]本发明涉及一种基于无缝克隆技术的基因定点突变方法，基于该方法制备的基因定点突变试剂盒及其应用的具体实施方案，属于基因工程技术领域。
背景技术
[0002]基于PCR技术的基因定点突变是分子生物学和蛋白质工程中研究基因调控、蛋白质结构与功能必不可少的工具。基因定点突变方式主要包括碱基替换、删除、插入，多位点突变，一个或多个位点的随机突变。许多基于PCR技术的基因定点突变方法已被商业化，其中最普遍使用的方法包括以下几种：
[0003](1)重叠延伸PCR法(overlap extension method)。该方法中使用的正反引物含有互补的重叠区。采用重叠延伸PCR技术扩增获得的产物是一种含有靶突变位点、有开口的、松弛的环状质粒(Sun SH,Huang H,Billy Qi YC,Qiu MS and Dai ZM.Complementary annealing mediated by exonuclease:a method for seamless cloning and conditioning site-directed mutagenesis.Biotechnology&Biotechnological Equipment.2015,29(1):105-110)；
[0004](2)大引物PCR法(megaprimer method)。该方法一般需要三条引物，首先由突变引物和相应的外侧引物进行第一轮PCR反应得到大引物，经纯化后与另一外侧引物进行第二轮PCR获得目的片段(Ke SH
and Madison.Rapid and efficient site-directed mutagenesis by single-tube‘megaprimer’PCR method.Nucleic Acids Research.1997, 25(16):3371-3372)；
[0005](3)快速更换法(Quick Change Method(Agilent Technologies,La Jolla,CA, USA))。快速更换法是使用一对含有部分或完全互补重叠区的引物，结合PfuTurbo DNA聚合酶扩增环状质粒。PCR指数扩增产生的单链DNA分子会在退火时，通过交叉切断单链DNA产生环状质粒(Xia YZ,Chu WQ,Qi QS and Xun LY.New insights into the QuikChange process guide the use of Phusion DNA polymerase for site-directed mutagenesis.Nucleic Acids Research.2015,43(2):2-9)。
[0006]但这些方法也存在如下不足之处：
[0007](1)当PCR扩增产物浓度低时，突变质粒的构建效率很低；
[0008](2)高保真DNA聚合酶具有微弱的链置换反应活性，它可能会引发链置换反应，并将该产物指数扩增放大化；
[0009](3)细胞生物学实验中常用的工具质粒都比较大，比如四环素诱导的基因过表达载体pLVX-Tight-Puro大小为7791bp，荧光素酶报告系统载体pmirGLO大小为7350bp。使用一对引物有时难以扩增出上述包含目的基因的重组载体，需要购买价格昂贵、具有长片段扩增能力的高保真酶；
[0010](4)由于使用互补的引物对，上述方法都会受插入或删除片段大小的限制；[0011](5)大引物PCR进行定点突变，大引物和外侧引物退火温度(Tm)必需相差显著，且
突变效率不能达到100％。
[0012]最重要的是，上述三类方法主要适用于单位点基因突变，而对多位点突变并不有效。为解决这一问题，田静等报道了一种基因定点多位点突变的方法，它是利用引物互补区对有开口的环状质粒模板完成聚合酶链式反应，从而引入多于一个位点的定点突变。但该方法操作繁琐，因为每引入一个突变位点，就要重新加入一对突变引物进行一轮PCR反应(中国专利CN101580829B)。此外，近几年国内外多篇文献报道了一种基于PCR与类型IIs限制性内切酶的基因定点突变技术，可以满足多位点基因突变需求。但该方法操作繁琐，需要依次进行PCR、酶切、连接等多步步骤(Zhang ZQ,Xu K,Xin Y and Zhang ZY.An efficient method for multiple site-directed mutagenesis using type IIs restriction enzymes.Analytical Biochemistry.2015,476:26-28)。
[0013]同源重组(Homologous recombination,HR)是一对同源DNA片段交换核苷酸的过程，它是修复DNA断裂最主要的方式。同源重组最先用于酵母菌中遗传物质的改造。随后，发现一类噬菌体酶能够独立于细菌体系完成同源重组反应，并被用于质粒、细菌人工染体和细菌基因组的改造。近年来基于体外同源重组的无缝克隆技术被愈来愈受重视，该方法不受载体和目的片段的酶切位点限制，是一种通过
重组酶，在体外直接将目的片段与载体无缝拼接的基因克隆技术。该技术相对传统的基于限制性内切酶与连接酶进行基因克隆的技术，具有快速简便、PCR产物一步定向克隆、灵活的克隆位点和效率高的特点。
[0014]综上所述，综合运用无缝克隆技术与重叠延伸PCR技术，建立一种不依赖于限制性内切酶与连接酶，可以快速、高效的在载体的任意位点实现一个或多个位点突变的技术，将是未来最普遍使用的一种基因定点突变技术。
发明内容
[0015]本发明的目的：针对现有技术存在的上述不足，基于最新的无缝克隆技术，提供一种快速简便、高效率，可以在载体任意位置实现单位点或多位点、连续或不连续突变的基因定点突变方法
[0016]发明内容之一：一种基于无缝克隆技术的基因定点突变方法
[0017]本发明所述方法通过在引物5′端同源臂中引入突变位点的方式，同时联合高保真DNA聚合酶扩增，制备包含突变位点的质粒片段。然后，通过无缝克隆技术，将2-5个两端含有同源臂的质粒片段进行体外同源重组反应，从而实现单个或多个位点、连续或不连续位点突变。
[0018] 1.引物设计
[0019](1)引物包含5′端同源臂和3′端延伸区，其中同源臂大小为15-20bp，延伸区大小为0-20bp，突变位点包含在一个同源臂中；
[0020](2)正向和反向扩增引物的T m值最好在55-65℃范围之内，且两者T m差值最好不要超过1℃范围。
[0021] 2.引物设计示范举例
[0022]
[0023]突变正向引物1和突变反向引物2为一对引物，突变正向引物3和突变反向引物4为一对引物，PCR扩增的两个片段通过无缝克隆技术进行体外拼接，从而构建包含单个位点突变的重组质粒。
[0024]发明内容之二：一种基于无缝克隆技术的基因定点突变方法的应用
[0025]本发明利用上述基于无缝克隆技术的基因定点突变方法在人源MEK1蛋白和一种嵌合型半胱氨酸脱硫酶EH-IscS中，分别引入1个和2个突变位点，测序结果确认突变效率达到100％，说明本发明所述方法稳定可靠、效率高，为实验室提供了一种强有力的基因分析与蛋白质功能研究的常规方法。
[0026]发明内容之三：一种基于无缝克隆技术的基因定点突变试剂盒
[0027]本发明专利提供一种基于无缝克隆技术的基因定点突变试剂盒，除试剂盒包装、衬垫、试剂管和使用说明书以外，该试剂盒组成成分包括：(1)高保真DNA聚合酶预混液；(2) Dpn I和10×Dpn I buffer；(3)无缝克隆酶和5×无缝克隆缓冲液；(4)DMT感受态细胞；(5)对照质粒和对照质粒的通用鉴定引物；(6)无菌ddH2O。
[0028]其中所述高保真酶预混液购自以下公司：南京诺唯赞生物科技有限公司，2×Phanta Master Mix，货号P511-01/02/03，2×Phanta Max Master Mix，货号P515-01/02/ 03。所述Dpn I和10×Dpn I buffer可
分别购自以下公司：宝生物工程(大连)有限公司，QuickCut TM Dpn I，货号1609；碧云天生物技术研究所，Dpn I，货号D6257。所述DMT感受态细胞、对照质粒和对照质粒的通用鉴定引物由温州医科大学酶工程与医学诊断研究所提供。所述无缝克隆酶和无缝克隆缓冲液可分别购自以下公司：和元生物技术(上海)股份有限公司，ClonFast无缝克隆试剂盒；南京诺唯赞生物科技有限公司，同源重组一步克隆试剂盒，货号C112-01/02；南京金斯瑞生物科技有限公司，CloneEZ PCR克隆试剂盒，货号L00339；Clontech，Seamless Cloning with In-Fusion Cloning Kits，货号638911/638918；Invitrogen，Seamless Cloning and Assembly Enzyme Mix，货号A14606。所述无缝克隆酶和无缝克隆缓冲液也可以通过参考文献(Zhang Y,Werling U,Edelmann W.Seamless Ligation Cloning Extract(SLiCE)cloning method.Methods Mol Biol.2014,1116:235-244)制备生产。所述灭菌水是本领域常规试剂。本发明所述试剂盒中DMT感受态细胞置于-70℃保存，其它成分置于-20℃保存。本发明所述试剂盒的制备方法如常规。
[0029]本发明所述一种基于无缝克隆技术的基因定点突变方法及其应用，具备以下创新点和技术优势：
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