(10)申请公布号 (43)申请公布日 2014.01.01
C N 103478413
A (21)申请号 201310427156.3
(22)申请日 2013.09.18
A23K 1/00(2006.01)
A23K 1/14(2006.01)
(71)申请人中国林业科学研究院林产化学工业
研究所
地址210042 江苏省南京市玄武区锁金五村
16号
(72)发明人王成章 周昊
(54)发明名称
方法
(57)摘要
本发明涉及一种以银杏叶渣为原料进行混菌
固态发酵生产蛋白饲料的方法。分别将热带假丝
燥、粉碎后，加入一定量的水和氮源，混合、灭菌后
作为固态发酵培养基；将四种液体菌种按一定比
例接入固态发酵培养基，充分混匀，在温度28～
30℃条件下，自然PH 值下发酵72～120h ，干燥
后即得银杏叶渣蛋白饲料。该蛋白饲料中粗蛋白
含量高，可达46%，营养成分全面，适口性好，能有
效提高畜禽的生产性能和饲料转化率，并且制备
方法工艺简便，成本低，可实现大规模生产。本发
明还为林业加工废弃物银杏叶渣的利用提供了途
径。
(51)Int.Cl.
权利要求书1页 说明书12页 附图1页
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书12页 附图1页(10)申请公布号CN 103478413 A
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1.一种混菌固态发酵银杏叶渣生产蛋白饲料的方法，其特征在于，以银杏叶渣为原料，采用热带假丝酵母、米曲霉、枯草芽抱杆菌和植物乳杆菌对银杏叶渣进行混菌固态发酵，包括以下步骤：
菌种培养
a.热带假丝酵母菌的扩增培养：将热带假丝酵母活化后接种到装有5mL 麦芽汁培养基的大试管中，28℃培养24h ，然后以5%的接种量接种于装有500mL 麦芽汁培养基的三角瓶中，28℃恒温摇床（180r/min ）培养36h ，得到热带假丝酵母液体菌种；
b.米曲霉菌的扩增培养：将米曲霉活化后接种到装有5mLCzapek’s 液体培养基的大试管中，28℃培养24h ，然后以5%的接种量接种于装有500mLCzapek’s 液体培养基的三角瓶中，28℃恒温摇床（180r/min ）培养36h ，得到米曲霉液体菌种；
c.枯草芽孢杆菌的扩增培养：将枯草芽孢杆菌活化后接种到装有5mLBPY 液体培养基的大试管中，28℃培养24h ，然后以5%的接种量接种于装有500mLBPY 液体培养基的三角瓶中，28℃恒温摇床（180r/min ）培养36h ，得到枯草芽孢杆菌液体菌种；
d.植物乳杆菌的扩增培养：将植物乳杆菌活化后接种到装有5mLMRS 液体培养基的大试管中，28℃培养24h ，然后以5%的接种量接种于装有500mLMRS 液体培养基的三角瓶中，28℃恒温摇床（180r/min ）培养36h ，得到植物乳杆菌液体菌种；
（2）制备固态发酵培养基
将银杏叶渣进行干燥、粉碎后，加入银杏叶渣重量2～4倍的水，然后加入银杏叶渣重量5～12%的氮源，混合均匀后，在120～125℃下蒸汽灭菌20～30min ，冷却后得到银杏叶渣固态发酵培养基；
（3）混菌固态发酵制备蛋白饲料
将上述热带假丝酵母液体菌种、米曲霉液体菌种、枯草芽孢杆菌液体菌种和植物乳杆菌液体菌种按一定菌种比例分别接入银杏叶渣固态发酵培养基中，四种液体菌种的接种总量为固态发酵培养基重量的8～12%，接种完毕后充分混匀，然后在温度28～30℃条件下，自然PH 值下静止发酵72～120h ，最后将发酵产物在50℃条件下烘干至恒重，即得银杏叶渣蛋白饲料。
2.如权利要求1所述的一种混菌固态发酵银杏叶渣生产蛋白饲料的方法，其特征在于：所述的银杏叶渣是由3～6年生银杏幼叶经提取银杏黄酮后的叶渣进行风干后所得。
3.如权利要求1所述的一种混菌固态发酵银杏叶渣生产蛋白饲料的方法，其特征在于：步骤（2）中所述的氮源为尿素或硫酸铵。
4.如权利要求1所述的一种混菌固态发酵银杏叶渣生产蛋白饲料的方法，其特征在于：步骤（3）中所述的热带假丝酵母液体菌种、米曲霉液体菌种、枯草芽孢杆菌液体菌种和植物乳杆菌液体菌种的接入菌种
比例为1～2：2：1～2：1。
5. 如权利要求3所述的一种混菌固态发酵银杏叶渣生产蛋白饲料的方法，其特征在于：所述固态发酵制备得到的银杏叶渣蛋白饲料中粗蛋白含量为45～48%，乳酸含量为2.0～2.5%，粗纤维含量为6～8%。权 利 要 求 书CN 103478413 A
一种混菌固态发酵银杏叶渣生产蛋白饲料的方法
技术领域
[0001] 本发明属于农林废弃物加工利用技术领域，特别是涉及一种以银杏叶渣为原料进行混菌固态发酵生产蛋白饲料的方法。
背景技术
[0002] 随着我国畜牧业和饲料工业的快速发展，我国对饲料原料的需求量急增，使我国的饲料资源尤其是蛋白质资源更加紧缺，据统计到2012年，全国蛋白饲料可供量为0.22亿吨，需求量为0.66亿吨，可见我国蛋白饲料的供给量已经严重不足。一方面我国蛋白饲料资源缺乏，另一方面由于饲用抗生素的长期使用，现有的饲料营养价值大多较低以及不容易被动物消化吸收，导致饲料的安全性、品质和利用率都比较低。因此积极利用农林废弃物开发具有生物酶活性的植物蛋白饲料，对于弥补市场上蛋白饲料的不
足和提高饲料的安全性和利用率具有极为重要的意义。
[0003] 银杏树是我国特有的珍贵树种，我国银杏资源丰富，占世界总量的80％以上。由于银杏叶具有多种生物活性物质，被广泛应用于医药、生物农药、保健食品和化妆品行业中。银杏叶提取活性物后产生大量的银杏叶渣，每年大概有3万吨左右的银杏叶渣作为废弃物被扔掉或焚烧，不仅造成资源的严重浪费，而且会污染环境。银杏叶渣中含有丰富的蛋白质和氨基酸，含量达到30％以上，含有9种必需氨基酸，另外银杏叶渣中还含有丰富的多糖、VC、VE、胡萝卜素、矿物质和微量元素等。因此以银杏叶渣为原料制备菌体蛋白饲料，不仅可以变废为宝，使银杏叶资源走上绿循环发展之路，而且为银杏叶资源的开发利用注入新的活力，具有广阔的市场发展前景。
[0004] 菌体蛋白饲料的生物转化大都采用微生物单一菌株或组合菌株发酵，从目前的研究和应用来看，混合发酵的效果要比单菌种发酵的效果好。混合发酵利用了微生物种间协作、协同互生的特性，多个菌种之间可互相补偿其缺陷，共同生长。微生物发酵生产饲料的方法主要包括液态发酵和固态发酵两种，固态发酵具有液态发酵所不具有的优点，如废水废渣少，容易处理，能耗低，培养基原料多为天然基质或废渣，环境污染小，因此，现在在发酵饲料生产方面大多采用固态发酵的方式。
[0005] 目前国内外仅有以银杏叶为原料制备生物饲料的专利报道，而关于银杏叶渣制备生物饲料的专利报道很少。如专利201210549464.9报道了以银杏叶为原料，采用单一菌种芽孢杆菌进行固态发酵制备
生物饲料添加剂；专利200910031310.9报道了以银杏叶为原料，采用单一菌种产朊假丝酵母进行固态发酵制备生物饲料添加剂；专利200910031310.9报道了以银杏叶、食用菌废菌渣、豆粕为原料，采用单一菌种黑曲霉进行发酵制备生物饲料添加剂。这些专利均采用单一菌种进行发酵，制备得到的生物饲料存在蛋白含量低、营养成分单一、消化吸收差和适口性差等问题。在银杏叶渣制备生物饲料方面仅有专利201010295193.x报道了将银杏药渣、秸秆加水密封后直接发酵，该方法没有添加任何菌种直接发酵，制备得到的发酵饲料蛋白含量低、营养价值低，且该方法采用液态发酵，产生大量的废水，处理难、能耗高，且污染环境。
[0006] 针对以上发明的不足，本发明提出以银杏叶渣为原料采用混菌固态发酵的方法生产蛋白饲料。该方法采用混合菌种发酵，制备得到的银杏叶渣蛋白饲料中不仅蛋白含量高，且含多种维生素、多种活性酶、多种氨基酸和多种微量元素，营养成分全面，饲料消化吸收好，适口性好；采用固态发酵的生产方式，废水废渣少，容易处理，能耗低，环境污染小。该发明利用银杏叶渣这一巨大的资源，发酵制备营养全面的蛋白饲料，不仅可变废为宝，使银杏叶走上绿可循环发展的道路，且该方法将为银杏叶渣的开发应用提供技术支撑。
发明内容
[0007] 本发明的目的在于提供一种以银杏叶渣为原料进行混菌固态发酵生产蛋白饲料的方法，该方法能
耗低，环境污染小，绿安全，操作简单，生产成本低，且制备得到的银杏叶渣蛋白饲料蛋白含量高，营养成分全面，饲料消化吸收好，适口性好，适合工业化生产。[0008] 本发明是通过以下技术方案实现的。
[0009] 一种混菌固态发酵银杏叶渣生产蛋白饲料的方法，具体步骤如下：（1）菌种培养
a.热带假丝酵母菌的扩增培养：将热带假丝酵母活化后接种到装有5mL麦芽汁培养基的大试管中，28℃培养24h，然后以5%的接种量接种于装有500mL麦芽汁培养基的三角瓶中，28℃恒温摇床（180r/min）培养36h，得到热带假丝酵母液体菌种。
[0010] b.米曲霉菌的扩增培养：将米曲霉活化后接种到装有5mLCzapek’s液体培养基的大试管中，28℃培养24h，然后以5%的接种量接种于装有500mLCzapek’s液体培养基的三角瓶中，28℃恒温摇床（180r/min）培养36h，得到米曲霉液体菌种。
[0011] c.枯草芽孢杆菌的扩增培养：将枯草芽孢杆菌活化后接种到装有5mLBPY液体培养基的大试管中，28℃培养24h，然后以5%的接种量接种于装有500mLBPY液体培养基的三角瓶中，28℃恒温摇床（180r/min）培养36h，得到枯草芽孢杆菌液体菌种。
[0012] d.植物乳杆菌的扩增培养：将植物乳杆菌活化后接种到装有5mLMRS液体培养基的大试管中，2
8℃培养24h，然后以5%的接种量接种于装有500mLMRS液体培养基的三角瓶中，28℃恒温摇床（180r/min）培养36h，得到植物乳杆菌液体菌种。
[0013] （2）制备固态发酵培养基
将银杏叶渣进行干燥、粉碎后，加入银杏叶渣重量2～4倍的水，然后加入银杏叶渣重量5～12%的氮源，混合均匀后，在120～125℃下蒸汽灭菌20～30min，冷却后得到银杏叶渣固态发酵培养基。
[0014] （3）混菌固态发酵制备蛋白饲料
将上述热带假丝酵母液体菌种、米曲霉液体菌种、枯草芽孢杆菌液体菌种和植物乳杆菌液体菌种按一定菌种比例分别接入银杏叶渣固态发酵培养基中，四种液体菌种的接种总量为固态发酵培养基重量的8～12%，接种完毕后充分混匀，然后在温度28～30℃条件下，自然PH值下静止发酵72～120h，最后将发酵产物在50℃条件下烘干至恒重，即得银杏叶渣蛋白饲料。
[0015] 所述的银杏叶渣是由3～6年生银杏幼叶经提取银杏黄酮后的叶渣进行风干后所得。
[0016] 所述的氮源种类为尿素或硫酸铵。
[0017] 所述的假丝酵母液体菌种、米曲霉液体菌种、枯草芽孢杆菌液体菌种和植物乳杆菌液体菌种的接入菌种比例为1～2：2：1～2：1。
[0018] 所述的固态发酵制备得到的银杏叶渣蛋白饲料中粗蛋白含量为45～48%，乳酸含量为2.0～2.5%，粗纤维含量为6～8%。
[0019] 本发明采用的发酵菌种为热带假丝酵母、米曲霉、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌四种菌种组成的复合菌种。分别对四种菌种进行了扩增培养制备液体菌种，具体制备方法如下：
a.热带假丝酵母菌的扩增培养：将热带假丝酵母活化后接种到装有5mL麦芽汁培养基的大试管中，28℃培养24h，然后以5%的接种量接种于装有500mL麦芽汁培养基的三角瓶中，28℃恒温摇床（180r/min）培养36h，得到热带假丝酵母液体菌种。
[0020] b.米曲霉菌的扩增培养：将米曲霉活化后接种到装有5mLCzapek’s液体培养基的大试管中，28℃培养24h，然后以5%的接种量接种于装有500mLCzapek’s液体培养基的三角瓶中，28℃恒温摇床（180r/min）培养36h，得到米曲霉液体菌种。
[0021] c.枯草芽孢杆菌的扩增培养：将枯草芽孢杆菌活化后接种到装有5mLBPY液体培养基的大试管中，28℃培养24h，然后以5%的接种量接种于装有500mLBPY液体培养基的三角瓶中，28℃恒温摇床（180r/min）培养36h，得到枯草芽孢杆菌液体菌种。
[0022] d.植物乳杆菌的扩增培养：将植物乳杆菌活化后接种到装有5mLMRS液体培养基的大试管中，2
8℃培养24h，然后以5%的接种量接种于装有500mLMRS液体培养基的三角瓶中，28℃恒温摇床（180r/min）培养36h，得到植物乳杆菌液体菌种。
[0023] 本发明对发酵所用菌种种类进行了考察，分别进行了单一菌种发酵试验和复合菌种发酵试验。单一菌种发酵试验分别考察了热带假丝酵母、产朊假丝酵母、白地霉、米曲霉、黑曲霉、绿木霉、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌不同菌种对发酵产物粗蛋白含量的影响；将单菌发酵试验中筛选出的粗蛋白含量较高的酵母菌、霉菌与植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌进行2 菌、3菌和 4 菌的复合发酵试验，测定复合发酵产物中粗蛋白含量。结果表明，单一菌种发酵产物中粗蛋白含量最高的 4 种菌种为热带假丝酵母、米曲霉、枯草芽抱杆菌和植物乳杆菌；复合菌种发酵产物的粗蛋白含量要高于单一菌种的发酵产物，菌种组合为热带假丝酵母+米曲霉+枯草芽孢杆菌+植物乳杆菌的四菌组合发酵产物粗蛋白含量最高，因此，本发明采用的发酵菌种为热带假丝酵母、米曲霉、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌四种菌种组成的复合菌种。
[0024] 本发明以银杏叶渣为原料，通过加入一定量的水和氮源制备固态发酵培养基。将银杏叶渣进行干燥、粉碎后，加入银杏叶渣重量2～4倍的水，然后加入银杏叶渣重量5～12%的氮源，混合均匀后，在120～125℃下蒸汽灭菌20～30min，冷却后得到银杏叶渣固态发酵培养基，所述的氮源为尿素或硫酸铵。
[0025] 水分是微生物发酵所必需的基本物质之一，每种微生物都具有最适宜其生长的水分含量，这是因为水是微生物细胞的重要组成部分，是微生物进行代谢活动的介质，同时还参与一部分生化反应。
[0026] 本发明对固态发酵培养基的料水比进行了考察，料水比分别取1：1、1：2、1：3、1：4、1：5进行混菌固态发酵，测定发酵产物的粗蛋白含量，结果表明当料水比为1：2～1：4范围内，发酵产物中的粗蛋白含量均能达到45%以上，当料水比为1；5时，发酵产物中粗蛋白
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