(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011447070.3
(22)申请日 2020.12.09
(71)申请人 北京欣颂生物科技有限公司
地址 100000 北京市大兴区北京经济技术
开发区同济中路甲7号18幢10层1单元
1037室
(72)发明人 张海涛 王青
(51)Int.Cl.
A61K 8/64(2006.01)
A61K 8/99(2017.01)
A61Q 19/02(2006.01)
A61K 39/395(2006.01)
A61K 35/51(2015.01)
A61P 35/00(2006.01)
(54)发明名称
药物或化妆品
(57)摘要
制备得到的药物或化妆品。本发明提供了脐带血
干细胞制备得到的外泌体以及具有高抗原免疫
原性表位的TRP ‑2片段，并且制备得到了多个特
异性的TRP ‑2单克隆抗体，所述抗体与外泌体一
起使用具有协同的增强抑制黑素瘤细胞增殖
的效果，能够用于制备美白的化妆品或者抑制黑
好的应用价值和前景。
权利要求书1页 说明书6页序列表2页 附图2页CN 112472621 A 2021.03.12
C N 112472621
A
1.一种药物组合物，其特征在于所述组合物中含有4F4单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO：2所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO：3所示。
2.一种化妆品，其特征在于：含有4F4单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO：2所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO：3所示；同时还含有脐带血干细胞外泌体。
3.如权利要求1或2所述的药物组合物或者化妆品，其特征在于所述单克隆抗体为抗体或其抗原结合片段。
4.如权利要求3所述的药物组合物或者化妆品，其特征在于所述抗体包括Fab，Fab ’，F (ab)2，Fv片段，F(ab ’)2，scFv，di ‑scFv和/或dAb。
5.如权利要求2所述的化妆品，其特征在于其中化妆品为精华液、眼霜、爽肤水、凝胶、面膜、护手霜等形式。
6.如权利要求5所述的化妆品，其特征在于进一步的还添加用于增加皮肤美白的成分的组合。 权 利 要 求 书1/1页CN 112472621 A
干细胞外泌体的制备方法及其制备得到的药物或化妆品
技术领域
[0001]本发明涉及药物和化妆品领域，更具体的，涉及干细胞外泌体的制备方法及其制备得到的药物或化妆品。
背景技术
[0002]外泌体(exosomes)是一类由细胞分泌到胞外的囊泡。外泌体具有独特的物理化学性质，其直径为30～200nm，密度为1.13～1.19g/mL，组成包括细胞来源相关的脂质、蛋白质、RNA、DNA等物质，在其表面连接有大量的糖链，如甘露糖、聚乳糖胺和α2，6‑唾液酸等。外泌体中常见的磷脂包括鞘磷脂、胆固醇、磷脂酰胆碱、神经酰胺、磷脂酰胆碱等。外泌体的完整囊泡结构能够保护其内部生物分子
不受体液中各种酶的影响从而保持其完整性和生物活性。例如，外泌体中包含的mRNAs和miRNAs在进入受体细胞后仍具有翻译蛋白质、促进病毒感染等功能。据估计，单个外泌体含有约≤100拷贝数的蛋白质和≤10000拷贝数的核苷酸。
[0003]由于外泌体能够反映其来源细胞的特性，不同干细胞来源的外泌体表现的生物功能也不尽相同，其中最受人们关注的一类干细胞外泌体来源于间充质干细胞。间充质干细胞存在于骨髓、脂肪、脐血、牙髓、滑膜液等部位，是一种能够自我更新的多功能干细胞。由于具有多向分化、促进组织修复、抗炎、免疫抑制和保护神经等功能，间充质干细胞在细胞领域有着独特的优势。大量研究工作表明，间充质干细胞通过旁分泌的形式发挥其生理功能，而外泌体作为一种细胞间传递信息的介质，在间充质干细胞的功能行使中发挥了重要作用。研究发现间充质干细胞来源的外泌体能够修复组织损伤、皮肤美白、抑制肿瘤生长等功效。
[0004]皮肤是人体最大的器官，位于人体结构的最外面。其主要功能是发挥免疫屏障作用，保护人体免受外界有害物质、病原体等入侵，还具有调节机体新陈代谢、感触觉等功能。然而，皮肤经常因各种内在病理及外界机械因素而受损，这些急、慢性的皮肤缺损给患者及社会带来了沉重的负担，此外，皮肤美白也是皮肤较为重要的选项。外泌体作为间充质干细胞旁分泌的一种亚细胞成分，其特殊的双分子层结构保护其内容物相对稳定且免受破坏，通过转运多种生物活性成分(蛋白质、脂质、核酸等)使其实现对受体细胞的多途径调节，在组织修复与再生、皮肤美白、揭示发病机制、参与免疫调节等方面都发挥
了重要的作用，使无细胞成为了可能。目前研究发现，外泌体作为干细胞旁分泌的载体，可以向受体细胞投递蛋白质、脂质、核酸等信号，从而影响其中的多个环节、多种细胞而促进皮肤的美白、修复与再生。
[0005]现有技术发现，甘草黄酮(光甘草定)是油溶性甘草提取物，是一种很好的美白成分。其美白作用主要来自其对酪氨酸酶的抑制、对多巴素互变异构酶(TRP‑2)活性的抑制以及对5,6‑二羟基吲哚(DHI)的聚合的阻碍。甘草提取物还可干扰细胞增殖周期，使细胞生长受到抑制。随着剂量的增加，黑素细胞数量明显减少进而实现美白效果。目前针对TRP‑2活性抑制的物质还不是很多。
[0006]此外，由于不同的干细胞分泌的外泌体其功效可能存在着效果不同的影响，而且协同美白的化妆品目前还不够多。因此，提供一种新的美白用外泌体组合物化妆品是本领域追求的目标。
发明内容
[0007]本发明首先提供了一种脐带血干细胞外泌体。所述外泌体能够用于抑制黑素瘤细胞的增殖，用于制备用于美白的化妆品或者用于抑制黑素瘤细胞增殖的药物。[0008]本发明另外提供一种具有高抗原活性的TRP‑2表位肽蛋白序列，其序列如SEQ ID NO：1所示。
[0009]本发明另外的一方面，提供了一种特异性针对TRP‑2的单克隆抗体。所述单克隆抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO：2所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO：3所示。
[0010]在某些实施方式中，所述单克隆抗体包含抗体或其抗原结合片段。
[0011]在某些实施方式中，所述抗体包括Fab，Fab’，F(ab)2，Fv片段，F(ab’)2，scFv，di‑scFv和/或dAb。
[0012]在某些实施方式中，所述抗体选自下组：单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。
[0013]本发明提供一种用于美白的化妆品或者用于抑制黑素瘤细胞增殖的药物，所述化妆品或者药物中含有所述的外泌体和特异性针对TRP‑2的单克隆抗体。
[0014]本发明涉及化妆品组合物。具体而言，公开了能够用于改善皮肤视觉外观的组合物和方法。在一些方面，本文公开的组合物可以包括例如用于去黑素细胞、增加皮肤美白的成分的组合。成分的这种组合可以被包含在宽范围的产品制剂中(例如，精华、眼霜、爽肤水、凝胶、面膜、面膜等)。
[0015]该组合物在非限制性方面可以具有约6至约9的pH值。在其它方面，pH可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14。组合物可以包含甘油三酸酯。非限制性实例包括小的、中等的和大的链甘油三酸酯。在一些方面，甘油三酸酯是中链甘油三酸酯(例如三辛酸癸酸甘油酯)。组合物还可以包含防腐剂。防腐剂的非限制性实例包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯或对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯的混合物。
[0016]本文公开的组合物还可以包含以下另外的成分的任意一种、任意组合或全部：水、螯合剂、保湿剂、防腐剂、增稠剂、含硅酮的化合物、精油、结构化剂、维生素、药物成分、非天然存在的化合物、或抗氧化剂、或这类成分的任意组合或这类成分的混合物。在某些方面，该组合物可以包含在之前句子中所指出的这些附加成分的至少二、三、四、五、六、七、八、九、十种或全部。这些附加成分的非限制性实例在本说明书通篇指出并通过引用并入本部分。这类成分的量可以是以组合物的重量或体积计的0.0001％至99.9％，或者如本说明书其它部分中所公开的任意整数或范围中，其通过引用并入本段。
[0017]本发明还提供包含本文公开的组合物的试剂盒。在某些实施方案中，该组合物包含在容器中。该容器可以是瓶子、分配器或包装。该容器可以分配预定量的组合物。在某些方面，以喷雾、团块或流体分配组合物。容器可以在其表面上包含标记。该标记可以是单词、缩写、图片或符号。
[0018]本发明还提供是本说明书通篇所公开的所述组合物可以被用作免洗型或洗去型
组合物。举例来说，免洗型组合物可以是被局部地施用至皮肤并在皮肤上保留一段时间(例如，至少5、6、7、8、9、10、20或30分钟，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时，或者整夜或整个白天)的组合物。或者，洗去型组合物可以是意在施用至皮肤、然后在一段时间如小于5、4、3、2或1分钟内从皮肤去除或洗去(比如用水)的产品。洗去型组合物的实例可以是皮肤清洁剂、洗发水、护发素或肥皂。免洗型组合物的实例子可以是皮肤保湿剂、防晒剂、面膜、晚霜或日霜。
[0019]有益效果
[0020]本发明提供了脐带血干细胞制备得到的外泌体以及具有高抗原免疫原性表位的TRP‑2片段，并且制备得到了特异性的TRP‑2单克隆抗体，所述抗体与外泌体一起使用具有协同的增强抑制黑素瘤细胞增殖的效果，能够用于制备美白的化妆品或者抑制黑素瘤细胞增殖的药物及其药物组合物。具有较好的应用价值和前景。
附图说明
[0021]图1 TRP‑2蛋白的免疫原性表位分析图
[0022]图2外泌体直径分布图
[0023]图3 TRP‑2 western blot结果图
[0024]图4 TRP‑2蛋白抑制效果图
具体实施方式
[0025]这里和所附权利要求书中所使用的术语或词字典意义或常规不应被解释为局限于此，发明人已经
发现，为了适当地定义术语的概念，本发明的最佳方法本身将在下面进行描述，可以根据本发明的原理按照技术意义和概念进行解释。
[0026]因此，本发明包括所公开的实施例，其公开内容仅在参考实施例和附图中描述于本发明的最优选实施例和本发明的技术精神中，当其应用可以用各种等效变化替换时，可以理解这些特征。
[0027]实施例1脐带血干细胞外泌体制备
[0028]培养P3代脐带血干细胞(货号：ZQ0266，上海中乔新舟生物科技有限公司)于10cm 培养皿中，待细胞增殖融合至80％，按照1:4进行传代；P4细胞融合至对数生长期时，弃培养基，PBS漂洗两次，加入无FBS的DMEM/F12培养基6mL/皿，24h后收取培养基于离新管中，进行外泌体的分离：①预冷低温离心机，超速离心机至4℃②300g，4℃离心10min，除细胞碎片③将离心后上清液移植超速离心管中，用PBS补齐④29500g，4℃离心20min，进一步去除细胞及碎片⑤0.22μm滤器过滤离心后上清，去除大于200nm的粒子⑥过滤后上清于另一超速离心管中，120000g，4℃离心90min⑦弃上清，无菌滤纸吸净管壁液体，管底即为外泌体，加入相应液体，‑80保存待用。NTA检测：使用经过滤的PBS 1ml复匀外泌体；擦拭样品池，确保光路上无颗粒附着外管壁；适度倾斜样品池缓慢注入外泌体溶液；将样品池放入仪器，按照仪器操作规程上机检测。结果如图1所示。
[0029]从图1的结果可以看出，对粒径分布特征最重要的参数进行统计分析结果为，所述外泌体粒径为30
‑110nm，粒径主峰为80nm，平均粒径78.6nm。
[0030]实施例2 TRP‑2蛋白高活性表位肽的筛选
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