(19)国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202111525352.5
(22)申请日 2021.12.14
(71)申请人 山东省农业科学院
地址 250100 山东省济南市历城区工业北
路202号
(72)发明人 徐同成 康佳惠子 吴汶静
杜方岭 刘丽娜 宗爱珍 贾敏
(74)专利代理机构 济南市易拓知识产权代理事
务所(普通合伙) 37325
专利代理师 邱兰双
(51)Int.Cl.
C12N 11/082(2020.01)
C12N 9/20(2006.01)
C12P 7/6445(2022.01)
(54)发明名称固定化Sn-2脂肪酶制备甘油二酯的方法(57)摘要本发明属于油脂加工技术领域，具体涉及一种固定化Sn ‑2脂肪酶制备1，3‑甘油二酯的方法。本发明通过树脂吸附Sn ‑2脂肪酶得到大孔树脂吸附的Sn ‑2脂肪酶，交联固定化Sn ‑2脂肪酶，以该酶一步水解得到1，3‑甘油二酯。本发明的方法提高了Sn ‑2位脂肪酶水解时的利用次数、水解活力和专一性，通过改善实验条件，确定了最佳参数，弥补了固定化的缺陷，实现了一步水解1，3‑甘油二酯。优选条件下，固定化脂肪酶CAL ‑A水解酶活为1937.86U/g，固定化率可达94.49%。并且具有较好的操作稳定性及储存稳定性，其次，DAG 含量可达 36.12%，明显优于目前的现有技术，且显著降低1，3‑DAG的生产成本与市场价值，为固
定化酶提供工业化生产提供有利价值。权利要求书1页 说明书18页 附图4页CN 114480360 A 2022.05.13
C N 114480360
A
1.固定化Sn‑2脂肪酶制备甘油二酯的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1 树脂吸附Sn‑2脂肪酶：移取Sn‑2脂肪酶原酶液于离心管中，加入预处理的湿载体大孔树脂，于水浴振摇吸附，分散均匀后反应完成，抽滤后晾干过夜，烘干，得到被大孔树脂吸附的Sn‑2脂肪酶；
S2 交联固定化Sn‑2脂肪酶：树脂吸附完成后，加入交联剂，振荡交联，过滤，缓冲液洗涤，过滤，烘干，冷藏，得到固定化Sn‑2脂肪酶大孔树脂；
S3 水解：向油脂原料加入固定化Sn‑2脂肪酶大孔树脂，一步水解得到1，3‑甘油二酯。
2.如权利要求1所述的固定化Sn‑2脂肪酶制备甘油二酯的方法，其特征在于，S1中，大孔树脂预处理方
式为：用95%无水乙醇浸泡24h，不停搅拌使其溶解完全，真空抽滤，用蒸馏水不断冲洗至水中不再混浊且无明显乙醇气味，洗去残留的杂质以及无水乙醇，浸泡在去离子水中密封于4℃条件下保存备用。
3.如权利要求1所述的固定化Sn‑2脂肪酶制备甘油二酯的方法，其特征在于，S1中，大孔树脂型号为RDK09、DA201、LXT‑008、HPD700、HPD100、X‑5、HPD750中的任一种。
4.如权利要求1所述的固定化Sn‑2脂肪酶制备甘油二酯的方法，其特征在于，S1中，水
浴振摇吸附的条件为：25
~70℃下，250r/min水浴摇床振摇12h。
5.如权利要求1所述的固定化Sn‑2脂肪酶制备甘油二酯的方法，其特征在于，S1中，吸
附条件为：缓冲液pH为5.5
~9，吸附温度35
~
60℃，给酶量100
~
400mg/g，吸附时间为10
~
14h。
6.如权利要求1所述的固定化Sn‑2脂肪酶制备甘油二酯的方法，其特征在于，S2中，交联剂为戊二醛、乙二醛、乙二酸二缩水甘油醚、1,4丁二醇二缩水甘油醚中的任一种，其中交联剂体积浓度为0.5%。
7.如权利要求1所述的固定化Sn‑2脂肪酶制备甘油二酯的方法，其特征在于，S2中，交
联条件为：交联温度35
~55℃，交联时间2
~
6h，交联剂用量为0.5
~
0.7%（体积）。
8.如权利要求1所述的固定化Sn‑2脂肪酶制备甘油二酯的方法，其特征在于，S2中，缓冲液为磷酸氢二钠‑柠檬酸缓冲液、磷酸二氢钾‑氢氧化钠缓冲液、磷酸氢二钠‑磷酸二氢钠缓冲液、纳‑盐酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液、甘氨酸‑氢氧化钠缓冲液中的任一种。
9.如权利要求1所述的固定化Sn‑2脂肪酶制备甘油二酯的方法，其特征在于，S3中，油脂原料为植物油脂。
10.如权利要求1所述的固定化Sn‑2脂肪酶制备甘油二酯的方法，其特征在于，S3中，水
解条件为：水解温度60
~65℃，水解时间7
~
8h，加酶量6
~
10%（体积），加水量3.5
~
6%（体积）。
权 利 要 求 书1/1页
CN 114480360 A
固定化Sn‑2脂肪酶制备甘油二酯的方法
技术领域
[0001]本发明属于油脂加工技术领域，具体涉及一种固定化Sn‑2脂肪酶制备甘油二酯的方法。
背景技术
[0002]甘油二酯（Diacylglycerol, DG，DAG），是油脂中的一种结构脂质。DAG是天然植物油脂的微量成分及体内脂肪代谢的内源中间产物，它是公认安全（GRAS）的食品成分。近年来发现，膳食DAG具有减少内脏脂肪、抑制体重增加、降低血脂的作用，因而受到广泛的关注。
[0003]目前，对于甘油二酯的制备，现有研究大多是关于水解制备1，3‑甘油二酯的脂肪酶均为Sn‑1，3倾向性脂肪酶或无特异性脂肪酶，缺乏对Sn‑2位倾向性脂肪酶的研究。且制备甘油二酯最简单的方法为两部水解法，虽现有技术可一步水解制备得到甘油二酯，且水解法较为简单，但是水解度难以控制，如果加水量过多，则会产生大量油酸与MAG，如若水解不够，则不能转化为所需甘油二酯。
发明内容
[0004]为解决上述技术问题，本发明提供了一种固定化Sn‑2脂肪酶的方法，并以该固定化Sn‑2脂肪酶一步水解制备了1，3‑甘油二酯，为1，3‑甘油二酯的制备提供新思路。[0005]本发明的方法提高了Sn‑2位脂肪酶水解时的利用次数、水解活力和专一性，通过改善实验条件，弥补了固定化的缺陷，实现了一步水解1，3‑甘油二酯，显著降低1，3‑DAG的生产成本与市场价值，为固定化酶提供工业化生产提供有利价值。
[0006]本发明是通过以下技术方案来实现的：
固定化Sn‑2脂肪酶制备1，3‑甘油二酯的方法，包括如下步骤：
S1 树脂吸附Sn‑2脂肪酶：移取Sn‑2脂肪酶原酶液于离心管中，加入预处理的湿载体大孔树脂，于水浴振摇吸附，分散均匀后反应完成，抽滤后晾干过夜，烘干，得到被大孔树脂吸附的Sn‑2脂肪酶；
S2 交联固定化Sn‑2脂肪酶：树脂吸附完成后，加入交联剂，振荡交联，过滤，缓冲液洗涤，过滤，烘干，冷藏，得到固定化Sn‑2脂肪酶大孔树脂；
S3 水解：向油脂原料加入固定化Sn‑2脂肪酶大孔树脂，一步水解得到1，3‑甘油二酯。
[0007]优选的，Sn‑2脂肪酶为南极假丝酵母脂肪酶A。
[0008]优选的，S1中，大孔树脂预处理方式为：用95%无水乙醇浸泡24h，不停搅拌使其溶解完全，真空抽滤，用蒸馏水不断冲洗至水中不再混浊且无明显乙醇气味，洗去残留的杂质以及无水乙醇，浸泡在去离子水中密封于4℃条件下保存备用。
[0009]优选的，S1中，大孔树脂型号为RDK09、DA201、LXT‑008、HPD700、HPD100、X‑5、HPD750中的一种。
[0010]优选的，S1中，水浴振摇吸附的条件为：25~70℃下，250r/min水浴摇床振摇12h。
[0011]优选的，S1中，吸附条件为：缓冲液pH为6.0~10，吸附温度50.5℃，给酶量200mg/g，吸附时间为10~11h。
[0012]优选的，S2中，交联剂为0.5%、1.0% 的戊二醛、乙二醛、乙二酸二缩水甘油醚、1,4丁二醇二缩水甘油醚中的一种，其中交联剂体积浓度为0.5~1.0%。
[0013]优选的，S2中，交联条件为：交联温度49~50℃，交联时间1~2h，交联剂用量为0.4~0.8%。
[0014]优选的，S2中，缓冲液为磷酸氢二钠‑柠檬酸缓冲液、磷酸二氢钾‑氢氧化钠缓冲液、磷酸氢二钠‑磷酸二氢钠缓冲液、纳‑盐酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液、甘氨酸‑氢氧化钠缓冲液中的一种。
[0015]优选的，S3中，油脂原料为动物油脂、植物油脂。
[0016]优选的，油脂原料为高油酸葵花籽油。
[0017]优选的，S3中，水解条件为：水解温度60~65℃，水解时间7~8h，加酶量7~9%，加水量3~4%。
[0018]进一步的，对游离脂肪酶CAL ‑A进行吸附固定化：首先从7种大孔树脂中筛选出相对酶活最高的中等极性大孔树脂HPD750，然后以其为载体通过吸附法固定游离的CAL ‑A脂肪酶，发现固定化的相对酶活及固定化率最高时的缓冲液为磷酸氢二钠‑柠檬酸。最后，为得到最佳吸附条件，本发明对缓冲液pH、吸附温度、给酶量、吸附时间四个因素进行了单因素和响应面实验，同时结合成本等因素，最终确定最佳吸附条件为缓冲液pH=8.00，吸附温度50.5℃，给酶量200mg/g，吸附时间10.1h，可得固定化酶CAL ‑A酶活为1610.67U/g ，固定化率达到82.39%。
[0019]进一步的，利用CAL ‑A吸附‑交联法对固定化脂肪酶固定化：选用5种不同交联剂比较固定化酶的
酶活力，选用乙二醛作为最佳交联剂，对交联时间、交联温度、交联剂用量三个因素进行了单因素和响应面实验，最终确定最佳交联条件为在交联温度49.4℃，交联时间1.76h，交联剂用量为0.6%的条件下，得到的固定化脂肪酶CAL ‑A水解酶活为1937.86U/g ，固定化率达到94.49%。
[0020]进一步的，游离酶与固定化酶CAL ‑A酶相关性质的研究结果：在温度方面：游离酶CAL ‑A的最适温度为70℃，大孔树脂吸附‑交联固定化酶的最适温度为60℃，最适温度虽然相较于游离酶CAL ‑A有所下降但热稳定性有所提升，大孔树脂吸附‑交联固定化酶在80℃时固定化CAL ‑A仍能保持90%的活力，而游离酶仅有64.71%。在pH值方面：在pH值为4到12的环境中，发现游离酶最适宜的pH值为8，而固定化酶最适宜的pH值为8.5，而且酸碱稳定性也有所提升。在有机溶剂方面：乙醇，石油醚、正己烷、乙酸对水解活力有明显的抑制作用，而乙酸乙酯、正丁醇、叔丁醇对固定化酶有激活作用。在金属离子和表面活性剂方面：金属离子Fe 2+对固定化酶的水解有激活作用，在实验过程中应避免与Zn 2+、Mn 2+、Ba 2+的接触；表面活性剂中0.0005%的EDTA对脂肪酶有激活作用，而0.001%的EDTA有抑制作用，并且固定化酶具有较好的操作稳定性及储存稳定性。
[0021]进一步的，固定化CAL ‑A水解得到1，3‑甘油二酯：以高油酸葵花籽油为原料，利用大孔树脂吸附‑交联法水解制备1，3‑甘油二酯。本发明以HPLC ‑ELSD法分析油脂中甘油二酯的含量，同时对水解时间、水解温度、加酶量、加水量四个因素进行了单因素和响应面实验，
最终确定最佳水解条件为水解温度为62.4℃，水解时间为7.5h，加酶量8.1%，加水量3.72%，该条件下DAG含量可达36.12%。
[0022]本发明的有益效果在于：
本发明创新性通过固定化Sn‑2位脂肪酶制备1，3‑甘油二酯，为1，3‑甘油二酯的制备提供新思路。本文首先对Sn‑2位脂肪酶进行固定化，进而能够以其为水解酶来一步水解油脂制备1，3‑甘油二酯，因为固定化能够提高Sn‑2位脂肪酶水解时的利用次数、水解活力和专一性。一步水解能够显著降低1，3‑DAG的生产成本与市场价值，为固定化酶提供工业化生产提供有利价值。
[0023]进一步的，具有突出的技术优势，通过单因素和响应面实验到了最佳工艺参数，优选条件下，固定化脂肪酶CAL‑A水解酶活为1937.86U/g，并且具有较好的操作稳定性及储存稳定性，DAG含量可达36.12%，明显优于目前的现有技术。
附图说明
[0024]图1‑A为不同缓冲液制备的固定化脂肪酶相对酶活和固定化率；
图1‑B为不同缓冲液pH制备的固定化脂肪酶相对酶活和固定化率；
图1‑C为不同吸附温度制备的固定化脂肪酶相对酶活和固定化率；
图1‑D为不同给酶量制备的固定化脂肪酶相对酶活和固定化率；
图1‑E为不同给酶量对固定化脂肪酶酶活回收率的影响；
图1‑F为大孔树脂不同吸附时间对固定化脂肪酶相对酶活和固定化率的影响；
图2为不同湿载体大孔树脂的相对酶活、固定化率和酶活回收率；
图3‑A为不同交联剂对固定化脂肪酶相对酶活的影响；
图3‑B为不同温度对固定化脂肪酶相对酶活和固定化率的影响；
图3‑C为不同交联时间对固定化脂肪酶相对酶活和固定化率的影响；
图3‑D为不同乙二醛浓度对固定化脂肪酶相对酶活和固定化率的影响；
图4‑A为最适温度下游离酶和固定化酶的相对酶活；
图4‑B为2小时后游离酶和固定化酶的相对酶活；
图4‑C为最适pH下游离酶和固定化酶的相对酶活；
图4‑D为2小时后固定化酶与游离酶相对酶活的影响；
图4‑E为不同有机溶剂（10%）对相对酶活的影响；
图4‑F为不同有机溶剂（20%）对相对酶活的影响；
图4‑G为不同金属离子（1mmol/L）对相对酶活的影响；
图4‑H为不同金属离子（5mmol/L）对相对酶活的影响；
图4‑I为不同金属离子（10mmol/L）对相对酶活的影响；
图4‑J为不同表面活性剂（0.0001%）对相对酶活的影响；
图4‑K为不同表面活性剂（0.0005%）对相对酶活的影响；
图4‑L为不同表面活性剂（0.001%）对相对酶活的影响；
图4‑M为固定化酶和游离酶密封保存60d的酶活力变化折线图；
图4‑N为缓冲液重复洗涤后固定化酶的相对酶活变化折线图；
图5‑A为不同水解时间对DAG含量的影响；
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