(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910478456.1
(22)申请日 2019.06.03
(71)申请人 鲁南制药集团股份有限公司
地址 276005 山东省临沂市红旗路209号
(72)发明人 张贵民 冀成法 王霞
(51)Int.Cl.
C12P 21/02(2006.01)
C12R 1/19(2006.01)
(54)发明名称一种用于生产甘精胰岛素的培养基及发酵方法(57)摘要本发明属于发酵工程领域，具体涉及一种用于生产甘精胰岛素的培养基及发酵方法，公开了其培养基配方及发酵过程各控制参数。将工程菌菌种在种子培养基中逐级放大培养，获得种子液；种子液接种至发酵罐基础培养基中进行高密度培养，分批次流加补料培养基至培养结束。本发明通过优化基础培养基与补料培养基组成、控制补加补料培养基的流速与补料量，获得高产甘精胰岛素的同时将质粒丢失率控制在10％以内，电泳表达量在34％以上。本发明的甘精胰岛素高密度发酵提高了生产效率，具有很好的应用前 景。权利要求书1页 说明书23页CN 112029810 A 2020.12.04
C N 112029810
A
1.一种用于生产甘精胰岛素的基础培养基，其特征在于，所述基础培养基包含甘油、酵母提取物、胰蛋白胨、氯化铵、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钠和微量元素。
2.根据权利要求1所述的基础培养基，其特征在于，所述微量元素包含硫酸亚铁、氯化钴、硫酸铜、氯化钙、氯化锌、硼酸、硫酸锰。
3.根据权利要求1所述的基础培养基，其特征在于，所述基础培养基组成为：
表1组分浓度(g/L)组分浓度(g/L)
Yeast extract 1.5～5KH 2PO 41～3
Tryptone 2.5～10MgSO 40.2～2
Glycerol 10～20NaCl 0.2～2
NH 4Cl 1～5微量元素0.4～0.6ml/L
Na 2HPO 4·12H 2O 25～35——
优选地，所述微量元素组成为：
表2组分浓度(g/L)组分浓度(g/L)
FeSO 4·7H 2O 10～20ZnCl 20.5～2.5
CoCl 2·6H 2O 1～5H 3BO 30.2～1
CuSO 4·5H 2O 0.2～1MnSO 4·H 2O 0.2～1
CaCl 25～15——
。
4.一种用于生产甘精胰岛素的发酵方法，其特征在于，步骤如下：
a、将工程菌菌种在种子培养基中逐级放大培养，获得种子液；
b、种子液接种至发酵罐基础培养基中进行高密度培养，分批次流加补料培养基，至培养结束。
5.根据权利要求4所述的发酵方法，其特征在于，所述补料培养基组成为：Tryptone 80～120g/L，Yeast extract 40～80g/L，Glycerol 400～600g/L，MgSO 4·7H 2O 1～3g/L。
6.根据权利要求4所述的发酵方法，其特征在于，所述种子液接种至发酵罐基础培养基中的接种量为：种子液的体积为基础培养基体积的5～10％。
7.根据权利要求4所述的发酵方法，其特征在于，高密度培养过程中，控制发酵液溶氧量不低于30％，温度为36.0～38.0℃，pH值为7.0～7.2；优选地，调控pH值的物质为氨水。
8.根据权利要求4所述的发酵方法，其特征在于，补料培养基用量为基础培养基体积的23～27％。
9.根据权利要求4所述的发酵方法，其特征在于，所述分批次流加补料培养基过程为：高密度培养过程中，溶氧和pH上升时，进行第一次流加补料培养基；加入诱导剂诱导后进行第二次流加补料培养基；优选地，所述溶氧上升，是指溶氧达到90％以上。
10.根据权利要求9所述的发酵方法，其特征在于，第一次流加补料培养基，控制流速每5～8h流加总补料量的30～35％；第二次流加补料培养基，控制流速每15～18h流加总补料量的65～70％。
权 利 要 求 书1/1页
CN 112029810 A
一种用于生产甘精胰岛素的培养基及发酵方法
技术领域
[0001]本发明属于发酵工程领域，具体涉及一种用于生产甘精胰岛素的培养基及发酵方法。
背景技术
[0002]发酵研究的主要目标在于使用高生产率技术使目的产品产生良好的成本效益。由于大多数蛋白在重组大肠杆菌中属于细胞内累积，故生产率与终细胞密度及单位生产率成正比关系。高密度发酵不仅可以提高生产率，还能降低培养容积、生产成本及设备投资，同时便于下游加工、减少废水排放，故高密度培养成为近年来发酵工业重要目标与方向之一。[0003]Pan(Adv Biochem Eng Biotechno，2003；85：43-93)等通过恒速流加培养，生产人生长激素，菌体OD600值达到120；Allen(Biophanmacology，1987；1：38-419)等曾用合成培养基培养重组大肠杆菌，菌密度达到了79g(DCW)/L，但外源蛋白没有表达；Jung(Ann Inst Pasteur Microbio，1988；139：129-146)等采用该技术生产干扰素，菌体浓度达到46g (DCW)/L，干扰素比生产率为17mg/g菌体；周宇荀(生物工程学报，2005，21(4)：615-625)等抗菌肽基因工程菌最高发酵密度达到OD600＝119，菌体浓度达到40g/L(DCW)，而目的蛋白表达量仅为5％左右，并有40％的工程菌丢失了质粒。变流速或梯度增加流加速度可以在菌体密度较高的情况下通过加入更多的营养物质促进细胞的生长，并对产物的表达有利。李民(生物工程学报，1998，14(3)：270-276)等采用三阶段式流加葡萄糖的方式，高密度培养重组菌YK537/pDH-B2m生产骨形成蛋白(BMP-2A)，发酵密度达OD600＝53，BMP-2A产量为2.78g/L。
[0004]基因工程菌在发酵过程中重组质粒会出现一定的不稳定性，将导致得不到预期的目的基因产物及产量。质粒的不稳定性分为DNA片段发生重组、缺失或插入的结构性不稳定和细胞分裂时质粒未进入子细胞的分离不稳定。质粒的稳定性受到宿主和质粒的基因型、宿主和质粒的相互作用、基因表达程度、培养温度、营养限制和反应器操作方式等多种遗传和环境因素的影响。基因工程发酵通常需要高密度菌体培养，以获得更多的目的产物，然而过高的菌体密度会影响工程菌的质粒稳定性。
[0005]工程菌高密度培养是获得外源基因表达产物的重要手段，但高密度培养的主要障碍之一是代谢副产物乙酸的积累。随着发酵培养密度的提高，乙酸的积累增加，并直接影响菌体的生长和外源蛋白的表达，逐渐成为制约工程菌高密度培养的重要因素。Jensen (Biotech Bioeng，1990；36：1-11)等报道当培养液中乙酸浓度大于6g/L时，乙酸会明显抑制菌体生长；当乙酸浓度大于2.4g/L时，会显著降低比产率。Konstan(Biotech Bioeng，1990；36(1)：750-758)等报道培养液中乙酸浓度大于15g/L时菌体生长就完全停止了。Boon (Biotechnol Letts，1992；14(12):1115-1118)等人利用从大肠杆菌衍生的三株宿主菌与对应的重组菌做乙酸抑制实验，发现重组菌比宿主菌更容易受到乙酸的抑制。
[0006]CN104726524A公开了一种培养基及用该培养基发酵生产甘精胰岛素前体的方法，通过添加盐类和微量元素来降低有害代谢产物(主要是乙酸)的积累，改善细胞生长，增加
菌体得率，虽然产量有所提升，但仍不理想；CN106282274A公开了一种胰岛素前体蛋白的毕赤酵母高
密度发酵方法，CN107022591B公开了一种提高胰岛素及其类似物前体表达的毕赤酵母发酵方法，均属于高密度发酵，但需发酵培养130h以上，发酵周期长。
[0007]基因工程菌高密度发酵，不仅需要获得高的菌体密度，还得兼顾乙酸的积累、质粒稳定性和高效表达，四者之间相互影响，相辅相成。通过以上专利和文献可以看出，现有技术通常只顾及了其中的一方面或几方面，特别是考察高密度培养过程中质粒稳定性的文献更少。因此基因工程菌仅按传统的发酵工艺进行生产是远远不够的，需要对影响高密度发酵和外源基因表达的因素进行综合分析，进而探索出一套适于外源基因高效表达的高密度发酵工艺。
发明内容
[0008]鉴于现有技术存在的诸多缺陷，本发明提供一种简单可行的既能提高甘精胰岛素产量，又能保证低质粒丢失率的培养基和发酵方法。
[0009]本发明的第一个目的在于提供一种用于生产甘精胰岛素的基础培养基，所述基础培养基包含甘油、酵母提取物、胰蛋白胨、氯化铵、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钠和微量元素。
[0010]优选地，所述微量元素包含硫酸亚铁、氯化钴、硫酸铜、氯化钙、氯化锌、硼酸、硫酸锰。
[0011]进一步优选地，每升基础培养基包括下表1所示的组份：
[0012]表1
[0013]
[0014]
[0015]进一步优选地，所述微量元素包括下表2所示的组份：
[0016]表2
[0017]
组分浓度(g/L)组分浓度(g/L)
FeSO4·7H2O10～20ZnCl20.5～2.5
CoCl2·6H2O1～5H3BO30.2～1
CuSO4·5H2O0.2～1MnSO4·H2O0.2～1
CaCl25～15——
[0018]本发明的第二个目的在于提供一种用于生产甘精胰岛素的补料培养基。所述补料培养基包含甘油、酵母提取物、胰蛋白胨、硫酸镁。
[0019]优选地，所述补料培养基组成为：Glycerol 400～600g/L，Yeast extract 40～80g/L，Tryptone80～120g/L，MgSO4·7H2O 1～3g/L。
[0020]本发明的第三个目的在于提供一种用于生产甘精胰岛素的发酵方法，技术方案如下：
[0021]a、将工程菌菌种在种子培养基中逐级放大培养，获得种子液；
[0022]b、种子液接种至发酵罐基础培养基中进行高密度培养，分批次流加补料培养基，至培养结束。
[0023]优选地，所述工程菌菌种为pET-Glargine/BL21(DE3)PlysS，构建方法参照专利CN1663960B。本发明方法也适用于产甘精胰岛素的pET-Glargine/BL21(DE3)，pET-Glargine/BL21star等菌株。
[0024]优选地，所述种子液接种至发酵罐基础培养基中的接种量为：种子液的体积为基础培养基体积的5～10％。
[0025]优选地，补料过程中所需补料培养基用量为：总补料量为基础培养基体积的23-27％。
[0026]优选地，补料过程中第一次流加补料培养基控制流速每5～8h流加总补料量的30～35％，第二次流加补料培养基控制流速每15～18h流加总补料量的65～70％。
[0027]优选地，高密度培养过程中，控制发酵液溶氧量不低于30％，温度为36.0～38.0℃，pH值为7.0～7.2。
[0028]发酵过程中会产生乙酸，大量乙酸的产生会降低pH，抑制菌体生长，为了降低乙酸对发酵的影响，需要对发酵体系的pH进行控制调整，优选地，用氨水来对反应体系的pH进行控制；氨水用量反映出反应体系产生乙酸的量。
[0029]以下内容进一步详述一种用于生产甘精胰岛素的发酵方法，包括如下步骤：[0030]a、将工程菌菌种在种子培养基中逐级放大培养，获得种子液；
[0031]步骤a种子液培养具体步骤如下：
[0032]接种工程菌菌种至固体种子培养基的斜面上，37.0℃培养12～15h，取出放冰箱2～8℃保存；挑取培养好的种子斜面菌落接种于液体种子培养基中，于恒温振荡器中37.0℃培养5～8h，得一级摇瓶种子液；将培养好的一级摇瓶种子液接种于液体种子培养基中，于恒温振荡器中37.0℃培养12～15h，得二级摇瓶种子液。
[0033]本发明不限定种子液培养步骤，任何现有的用于种子液培养的固体培养基、液体种子培养基及其培养方法均可用于本发明。
[0034]b、种子液接种至发酵罐基础培养基中进行高密度培养，分批次流加补料培养基，至培养结束。具体步骤如下：
[0035]按照5～10％的接种量接种二级摇瓶种子液至发酵罐基础培养基中，控制发酵罐内溶氧量不低于30％、温度36～38℃，使用氨水自动控制pH7.0～7.2。当溶氧上升且pH同时上升时，开始第一次流加补料培养基，控制流速每5～8h流加总补料量的30～35％，暂停补料后，pH和溶氧值会短暂上升。当培
养至OD600＝50～60时，加入诱导剂进行诱导。随后开始第二次流加补料培养基，控制流速每15～18h流加总补料量的65～70％，补料流加完毕发酵结束，总补料量为两次流加补料培养基的总量，为基础培养基体积的23～27％。
[0036]优选地，所述溶氧上升，是指溶氧达到90％。
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