(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811373858.7
(22)申请日 2018.11.19
(71)申请人 深圳市第二人民医院
地址 518000 广东省深圳市福田区笋岗西
路3002号
(72)发明人 廉翠红 朱艳霞 张远远
(74)专利代理机构 深圳中一专利商标事务所
44237
代理人 高星
(51)Int.Cl.
C12N 5/0775(2010.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种外
泌体的提取方法。该方法包括如下步骤：用含无
外泌体血清的培养基培养人脂肪来源间充质干
细胞，得到培养上清液，所述培养上清液中含有
后，取上清进行第二离心处理，然后取上清得到
离心液；将所述离心液用100KD超滤管进行超滤
浓缩处理，得到超滤液；将所述超滤液进行第三
离心处理后，用0.22μm过滤器进行过滤除菌处
理，得到浓缩液；将所述浓缩液进行第四离心处
理，弃上清得到所述外泌体。该方法可高效地从
人脂肪来源间充质干细培养上清液中提取到高
浓度、
高纯度的外泌体。权利要求书1页 说明书7页 附图3页CN 109536440 A 2019.03.29
C N 109536440
A
1.一种外泌体的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
用含无外泌体血清的培养基培养人脂肪来源间充质干细胞，得到培养上清液，所述培养上清液中含有外泌体；
将所述培养上清液进行第一离心处理后，取上清进行第二离心处理，然后取上清得到离心液；
将所述离心液用100KD超滤管进行超滤浓缩处理，得到超滤液；
将所述超滤液进行第三离心处理后，用0.22μm过滤器进行过滤除菌处理，得到浓缩液；将所述浓缩液进行第四离心处理，弃上清得到所述外泌体；
其中，所述第一离心处理的离心力为600-1000g，所述第二离心处理的离心力为2000-2800g，所述第三离心处理的离心力为9000-11000g，所述第四离心处理的离心力为90000-110000g。
2.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述第一离心处理的离心力为800g，所述第二离心处理的离心力为2500g，所述第三离心处理的离心力为10000g，所述第四离心处理的离心力为100000g。
3.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述100KD超滤管为15ml的超滤管。
4.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述超滤浓缩处理的条件为：离心力4000g，时间25min。
5.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述含无外泌体血清的培养基包括：10％无外泌体血清、高糖DMEM和1％青霉素/链霉素。
6.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述用含无外泌体血清的培养基培养人脂肪来源间充质干细胞的时间为24-48h。
7.如权利要求1-6任一项所述的提取方法，其特征在于，所述人脂肪来源间充质干细胞是：从脂肪组织中分离培养hADSCs得到第4代细胞后继续扩大培养得到融合度达80～90％的细胞。
8.如权利要求7所述的提取方法，其特征在于，所述从脂肪组织中分离培养hADSCs的方法包括：
收集脂肪组织样本，然后进行消化处理，得到消化液；
从所述消化液中收集含单个核细胞的液体后，移入完全培养基中终止消化，然后分离出原代人脂肪来源间充质干细胞；
将所述原代人脂肪来源间充质干细胞进行传代培养。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，用含有0.25％胰蛋白酶和0.1％I型胶原酶的消化液对所述脂肪组织样品中进行消化处理。
10.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述完全培养包括：10％胎牛血清、高糖DMEM和1％青霉素/链霉素。
权 利 要 求 书1/1页CN 109536440 A
外泌体的提取方法
技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种外泌体的提取方法。
背景技术
[0002]皮肤作为人体最大的器官总是会受到各种物理性、机械性、化学性和病原微生物性的侵袭。皮肤的抗氧化、抗衰老、抗炎及损伤修复是临床医师非常关心的研究问题。[0003]人脂肪来源间充质干细胞(human adipose-derived stem cells，hADSCs)是一类存在于脂肪组织中，具有自我更新和多向分化潜能的干细胞。通过旁分泌作用于成纤维细胞以及分泌促进其分泌1、2型的胶原和纤连蛋白，促进胶原合成，以发挥抗衰老、抗氧化作用；除此之外，hADSCs在不同的诱导因子作用下可以分化成脂肪细胞、成骨细胞、肌细胞、神经细胞，而且还可以能分泌多种促进细胞成熟的细胞因子和促进血管生成的因子，这些表明hADSCs具有抗炎、损伤修复的作用。因此，实际应用中，比如整形美容上，可以用hADSCs来除皱、瘢痕和疤痕的直接注射；另外，因为各种炎症、溃疡、烧伤等造成的皮肤损伤修复问题也有望通过hADSCs来解决。
[0004]外泌体(Exosomes)是一种被大多数细胞分泌的微小膜泡；近年来，外泌体凭借其大小及双分子膜等优势在多种疾病模型中呈现出了较细胞水平更为卓越的效果。随着外泌体研究增多，人脂肪来源间充质干细胞外泌体的相关研究也日益增多。然而，现有提取hADSCs及外泌体方法需要大量脂肪组织
和细胞，存在价格昂贵、费时费力的缺点。比如提取脂肪干细胞方法常使用机械设备，使得脂肪干细胞提取的细胞活力收到损伤，消化液也会损伤提取出来的脂肪干细胞，而且步骤冗杂。因此，要想获得高质、高量的脂肪干细胞，必须建立一套更简便有效的分离培养方法。
[0005]而外泌体领域的研究时间尚短，存在多种问题，如外泌体的提取方法学规范、统一定量及鉴定等。关于外泌体的提取有超速离心、试剂盒、超滤法、蔗糖密度梯度离心等，然而各种方法均有其利弊。超速离心法是目前外泌体相关文章中的主流方法，由于离心步骤繁琐，费事费力，而且步骤多导致实验中容易污染，且损耗量大，使得最终回收的外泌体不稳定。而且对于抽提细胞上清来说，更是极为不请便，试想用提取300ml的上清需要6个50ml离心管，无论是过滤还是后续的每一步的离心去沉淀，都具有操作极其不便的缺点，总之非常麻烦。而超滤法存在外泌体会堵塞膜孔，造成浓缩效率低，浓缩管重复利用差，甚至堵塞在膜孔的外泌体还可能会粘连成团，造成损失及最后的数据有误差，对于后续实验也有影响；最后浓缩液中外泌体的浓度不稳定，为后续实验操作和分析来带困扰等缺点。
[0006]因此，现有技术有待改进。
发明内容
[0007]本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种外泌体的提取方法，旨在解决现有外泌体提取步骤繁琐、成本高，以及提取效果不稳定的技术问题。
[0008]为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
[0009]本发明提供一种外泌体的提取方法，包括如下步骤：
[0010]用含无外泌体血清的培养基培养人脂肪来源间充质干细胞，得到培养上清液，所述培养上清液中含有外泌体；
[0011]将所述培养上清液进行第一离心处理后，取上清进行第二离心处理，然后取上清得到离心液；
[0012]将所述离心液用100kd超滤管进行超滤浓缩处理，得到超滤液；
[0013]将所述超滤液进行第三离心处理后，用0.22μm过滤器进行过滤除菌处理，得到浓缩液；
[0014]将所述浓缩液进行第四离心处理，弃上清得到所述外泌体；
[0015]其中，所述第一离心处理的离心力为600-1000g，所述第二离心处理的离心力为2000-2800g，所述第三离心处理的离心力为9000-11000g，所述第四离心处理的离心力为90000-110000g。
[0016]本发明提供的外泌体的提取方法，先用含无外泌体血清的培养基对人脂肪来源间充质干细胞进行饥饿培养，这样可使干细胞处于正常生长状态，不会被抑制生长增殖，其所分泌的外泌体所包含的有效
物质也更贴近其自然状态下的外泌体，然后将含有外泌体的培养上清液进行低速差速离心(即先第一离心处理、再第二离心处理)以去除细胞及其碎片，用100kd超滤管对低速差速离心后的离心液进行超滤浓缩得到外泌体浓度更高的超滤液，将超滤液经过第三离心处理去除杂质后直接用0.22μm过滤器过滤除菌，过滤掉粒径为220nm以上的物质，进一步得到含颗粒粒径小于220nm的浓缩液，因超滤浓缩处理和第三离心处理使得液体量浓缩，这样过滤除菌效率得到大大提高，最后将浓缩液进行超速离心的第四离心处理分离提取到外泌体。该外泌体的提取方法，既结合了差速离心，又结合了超滤和超速离心，通过该提取流程，最终可高效地从人脂肪来源间充质干细培养上清液中提取到高浓度、高纯度的外泌体，具有操作简单、成本低，适合产业化生产的特点。
附图说明
[0017]图1为发明的外泌体提取方法的流程示意图；
[0018]图2为本发明实施例1中分离得到的hADSCs在显微镜下观察到的形态图；[0019]图3为本发明实施例2中分离得到的外泌体在投射电镜下观察到的形态图；[0020]图4为本发明实施例5中分离得到的外泌体在DSL结果图；
[0021]图5为本发明实施例5中分离得到的外泌体做特征蛋白质免疫印迹结果图；[0022]图6为本发明实施例5中分离得到的外泌体做BCA蛋白定量结果图。
具体实施方式
[0023]为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0024]术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”、“第三”、“第四”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。
[0025]本发明实施例提供了一种外泌体的提取方法，包括如下步骤：
[0026]S01：用含无外泌体血清的培养基培养人脂肪来源间充质干细胞，得到培养上清液，所述培养上清液中含有外泌体；
[0027]S02：将所述培养上清液进行第一离心处理后，取上清进行第二离心处理，然后取上清得到离心液；
[0028]S03：将所述离心液用100kd超滤管进行超滤浓缩处理，得到超滤液；
[0029]S04：将所述超滤液进行第三离心处理后，用0.22μm过滤器进行过滤除菌处理，得到浓缩液；
[0030]S05：将所述浓缩液进行第四离心处理，弃上清得到所述外泌体；
[0031]其中，所述第一离心处理的离心力为600-1000g，所述第二离心处理的离心力为2000-2800g，所述第三离心处理的离心力为9000-11000g，所述第四离心处理的离心力为90000-110000g。
[0032]本发明实施例提供的外泌体的提取方法，先用含无外泌体血清的培养基对人脂肪来源间充质干细胞进行饥饿培养，这样可使干细胞处于正常生长状态，不会被抑制生长增殖，其所分泌的外泌体所包含的有效物质也更贴近其自然状态下的外泌体，然后将含有外泌体的培养上清液进行低速差速离心(即先第一离心处理、再第二离心处理)以去除细胞及其碎片，用100kd超滤管对低速差速离心后的离心液进行超滤浓缩得到外泌体浓度更高的超滤液，将超滤液经过第三离心处理去除杂质后直接用0.22μm过滤器过滤除菌，过滤掉粒径为220nm以上的物质，进一步得到含颗粒粒径小于220nm的浓缩液，因超滤浓缩处理和第三离心处理使得液体量浓缩，这样过滤除菌效率得到大大提高，最后将浓缩液进行超速离心的第四离心处理分离提取到外泌体。
[0033]该外泌体的提取方法，既结合了差速离心，又结合了超滤和超速离心，通过该提取流程，最终可高效地从人脂肪来源间充质干细培养上清液中提取到高浓度、高纯度的外泌体。具体地，本发明实施例的外泌体提取方法获得率高、纯度高：该提取方法因为步骤简单，不仅克服了现有单纯超速离心法步骤多来带的失误和混入杂质的缺点，而且解决了现有单纯超滤法多次浓缩后外泌体粘连在膜上造成的外泌
体流失的问题，因为选择了更大孔径的100KD超滤管来浓缩上清，100KD超滤管通过外泌体的大小是30-150nm的囊泡结构，如Alix 蛋白的分子量就大于100KD，这样可使外泌体更好地分离，太小的分子量容易发生滤孔堵塞；而且该提取方法价格低廉：超滤管和超离管均可重复利用3-5次，分离方法简单，综合起来成本低，节省人力和物力，适合产业化生产外泌体；操作简单，无需其他辅助工具或者仪器。
[0034]本发明实施例提取外泌体高效，能一次处理大量的细胞上清，而对于现有单纯的超速离心法，最大的超离管也才30ml，一次4h也单纯只能处理180ml(30ml*6，按照一个转头可以放6个这样的转子)，而本发明实施例浓缩后超离，一次能处理的细胞上清是单纯超速离心法的36倍。
[0035]本实施例提取到的外泌体电镜下看直径在30-150nm之间，呈均一大小的圆杯形态，FLOT1、ICAM、ALIX、CD81、CD63、EpCAM、ANXA5、TSG101等外泌体相关蛋白呈阳性表达，说明成功分离到人脂肪干细胞外泌体。
[0036]进一步地，所述100KD超滤管为15ml的超滤管。15ml的100kd超滤管可使150ml的上
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