・论著・ACE基因插入/缺失及β2肾上腺素受体基因多态性与房颤的相关性研究魏 玲，魏文婷，卢国良，杨晓华，张亚林，张筱军，付 莉，李晓玲，甘世保 (成都军区昆明总医院地方干部病房，云南昆明 650032)
摘要 目的：研究血管紧张素转换酶基因插入/缺失(ACEI/D)多态性及β2肾上腺素受体基因(β22AR+46A→G)多态性与心房颤动的相关性，寻房颤发病的分子机制。方法：选择55例房颤患者(房颤组)及63例非房颤者(对照组)，用PCR的方法检测两组ACE基因插入/缺失多态性，用RFL P法检测β22AR+46A→G变异。结果：房颤组与对照组ACEI/D多态性缺失纯合型(DD型)、杂合子(DI型)、插入纯合型(Ⅱ)基因型频率分别为32.76%、41.8%、25.5%和 19.0%、44.4%、36.5%；房颤组与对照组β22AR+46A→G多态性G ly16纯合型、Arg16纯合型、G ly16/Arg16基因型
频率分别是12.7%、17.47%、61.8%和14.3%、25.3%、60.3%；房颤组与对照组D等位基因、I等位基因分布频率为
53.6%、46.4%和41.2%、58.7%；房颤组与对照组G ly16等位基因、Arg16等位基因分布频率为39.6%、60.4%和
肉足虫>60sao
38.9%、61.1%；其中D等位基因分布频率在房颤组中较对照组明显增大；在9种不同基因型联合中发现,G ly/Arg型+
DD型和G ly型+DD型的两种联合在房颤组和对照组间的分布有明显差异(P<0.05)，且这两种联合基因型发病相对危险度(OR)=2.455(95%CI:1.080～5.579)。结论:D等位基因可能是房颤的易患因素;ACEDD基因型与心肌纤维化及心脏重构的关系较为紧密,β22AR基因+46A→G多态性、ID基因型和Ⅱ基因型与心肌纤维化及心脏重构无明显相关性;β22AR G ly16等位基因与ACEDD基因型的联合可能对房颤的患病有着潜在的影响。
关键词 心房颤动；心房重构;ACE基因I/D多态性;β2肾上腺素受体基因多态性
中图分类号 R541 文献标识码 A 文章编号 100420188(2008)0420495204
Study of association of polymorphism in angiotensin2concerting enzyme insertion/deletion gene andβ22adrenergic receptor 16locus genes with atrial f ibrillation
WEI Ling,WEI Wen2ting,L U Guo2liang,YAN G Xiao2hua,ZHAN G Ya2lin,ZHAN G Xiao2jun,FU Li,L I Xiao2ling,GAN Shi 2bao Depart ment of Cardiology,Kunming General Hospital of Chengdu Military Command,Kunming,650032,China.
Abstract Objective:T o study the association of polym orphism in the angiotensin2concerting enzyme(ACE)insertion/deletion(I/D)gene andβ22 adrenergic receptor16locus genes of Han people with atrial fibrillation(AF)in southwest China and the effects of gene polym orphisms on the structural rem odeling of atrial myocardium in order to explore the m olecular biological genesis of atrial fibrillation.M ethods:118unrelated Han subjects including55AF subjects and63non2AF ones were selected from our hospital.Their genotypes of ACE(I/D)gene andβ22AR16locus gene were identified by polymerase chain reaction(PCR)and PCR2restricted fragment length polymorphism assay(RFLP2PCR).R esu lt:The frequency of the DD,ID,II,allele D,allele I genotype of ACE in AF group and control group was32.76%,41.8%,25.5%,53.6%,46.4%and19.0%,44.4%,
36.5%,41.2%,58.7%,respectively.The frequency of the G ly16hom ozygotes,Arg16homozygotes,G ly16/Arg16,allele G ly16,allele Arg16
genotype ofβ22AR16locus gene in AF group and control group was12.7%,17.47%,61.8%,39.6%,60.4%and14.3%,25.3%,60.3%,38.
9%,61.1%,respectively.After the two kinds of genotypes were combined,it was found that the distribution of combination of DD genotype with allele G ly16had significant difference between AF gr
oup and control group.C onclusions:The polym orphism of ACE(I/D)gene andβ22adrenergic receptor16locus gene are not associated with AF,but the allele D may be the risk factor for AF.The DD genotype of ACE may have significant relationship with the structural rem odeling of atrial myocardium.The polym orphism of theβ22AR16locus genes,DI genotype and II genotype are also no associated with AF.Maybe there is a potential synergistic effect between DD genotype and allele G ly16on AF.
K eyw ords:atrial fibrillation;structural remodeling;β22adrenergic receptor16locus;genetic polymorphism;angiotensin2concerting enzyme insertion/deletion gene
心房颤动(at rial fibrillation,A F)是临床上最常见而复杂的心律失常之一。Framinghan的研究表明〔1〕,A F既是患者病死率增加的独立危险因素，亦是缺血性脑卒中、心衰的重要原因。目前其发生机制尚不清楚，近年来ACE基因多态性及β2肾上腺素能受体(β22A R，主要分布于心脏和血管上的肾上腺素能受体亚型)均受到关注〔2,3〕。本文对55例心房纤颤患者进行ACE及β22AR基因多态性的测定，并分析其与A F的相关性。
1 对象与方法
1.1 研究对象 (1)房颤组：本组55例中，男性31例，女性24例，平均(69.7±10.8)岁，房颤的发生与
持续时间通过病史采集和心电图证实。其中阵发性房颤22例，持续性房颤33例；并存高血压24例，冠心病28例(其中6例同时合并高血压及冠心病)，扩心病2例，肺
心病2例，病窦综合症2例，特发性3例。病程3个月到10年不等。已排除风湿性心脏病、甲亢性心脏病、肝纤维化、肺纤维化等及其肝肾功能不全者。(2)对照组: 63例对照组为同期体检或住院、经病史询问及心电图证实从未发生过房颤者，其中冠心病患者22例，高血压病患者18例，余为健康者；男性35例，女性28例，平均(63.73±13.01)岁。两组间性别、年龄、总胆固醇、甘油三脂、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白和EF、CO值未见显著性差异(P>0.05)；房颤组LAD37.68±8.11显著大于对照组32.67±7.89(P<0.05)。
1.2 试验方法 (1)标本采集：受试者清晨空腹，以ED TA抗凝管抽取肘静脉血7ml，其中2ml用以分离血清后检测血脂。分离出的血细胞-20℃冰冻保存，用于提取DNA。(2)分离提取DNA：用上海华舜生物工程有限公司的小量血液基因组DNA抽提试剂盒提取DNA。(3)ACE基因的提取扩增及其基因型的鉴定:ACE基因引物参照Rigat〔10〕设计，上游引物: CT GGA GACCACTCCCA TCC T T TC T，下游引物: GA T GT GGCCA TCACA T TCGTCA GA T，使用P TC 2200型PCR扩增仪进行扩增。ACE基因多态性分析：取DL2000Marker按6∶1(V∶V)加入上样缓冲液(15%Ficoll240，内含0.01%二甲苯晴兰和0.01%溴酚兰)，混匀后加样于2%琼脂糖凝胶电泳30min 为对照,30min后在紫外灯下观察并照相。根据凝胶中条带的位置判定相应的分子量和基因型，插入型等位基因I片段长度为490bp，缺失型等位基
因D片段长度为190bp。共有3种ACE基因型：仅有490bp 扩增带的为插入型纯合子(Ⅱ型)，仅有190bp扩增带的为缺失型纯合子(DD型)，具有490/190两条扩增带为杂合型(ID型)。(4)β22A R基因的提取扩增:β22 AR基因引物设计与合成,PCR引物设计参照Volke Herrmann的报道〔1〕。上游引物:5’2 GCC T TC T T GC T GGCACCCCA T23’，下游引物5’2 CA GAC GCTC GAAC T T GGCCA T G23’，使用P TC2 200型PCR扩增仪进行扩增。PCR扩增产物鉴定：取DL2000Marker按6∶1(V∶V)加入上样缓冲液(15%Ficoll240，内含0.01%二甲苯晴兰和0.01%溴酚兰)，混匀后加样于2%琼脂糖凝胶电泳30min为对照，于紫外分析仪下鉴定PCR产物。同时留取两例PCR产物样本测序(送至大连宝生物有限公司)；酶切;AgNO3染，并自然光照相，根据条带以鉴定β22 AR多态性。
1.3 统计学分析 用Excel软件建立数据库，所有计量资料用均数+标准差(±s)表示，所有数据采用SPSS 13.0软件包处理，并计算各基因型及等位基因发病的相对危险度，计量资料用t检验及单因素方差分析，组间比较用t检验,P<0.05为统计学有显著性差异。
2 结果
2.1 研究对象的Hardy2Weinberg平衡检验 房颤组与对照组β22A R各基因型频率和ACE受体各基因型频率观察数与期望数无显著性差异(见表1)，说明两组基因遗传平衡，数据来自同一孟德尔体。
表1 研究对象的Hardy2Weinberg平衡检验
基因型
房颤组
实际频数预计频数基因频率
对照组
实际频数预计频数基因频率
G ly16纯合型810.910.175912.440.143
G ly16/Arg16型3327.170.63831.120.603
Arg16纯合型1416.910.2541619.440.253
DD型1815.820.3271210.730.190
DI型2327.360.4182830.540.444
Ⅱ型1411.820.2542321.730.365
注：房颤组β22AR基因型χ2=3.62,P>0.05；对照组β22AR基因型χ2=3.09,P>0.05；房颤组ACE基因型χ2=1.394,P>0.05;
对照组β22AR基因型χ2=0.435,P>0.05
2.3 两组ACE基因型频率的检测
2.3.1 ACEI/D基因型分布频率 房颤组DD基因型在房颤组占32.76%,Ⅱ型占25.5%,DI型占41.8%，与对照组比较差异有显著性;D等位基因频率房颤组(53.6%)较对照组(46.4%)增大，其差异有显著性。D等位基因相对于I等位基因优势比OR= 1.646,95%可信区间为(0.983～2.758)，见表2。
表2 房颤组与对照组ACEI/D基因型分布比较〔例(%)〕
组 别n
ACEI/D基因型①
DD型DI型Ⅱ型等位基因频率②D I
房颤组5518(32.76)23(41.8)14(25.5)59(53.6)51(46.4)对照组6312(19.0)28(44.4)23(36.5)52(41.2)74(5
8.7) 注:①χ2=3.352,P=0.076>0.05;②χ2=3.605,P<0.05,OR= 1.646(95%CI:0.983～2.758)
2.3.2 β22AR基因型分布频率 两组β22A R基因型频率比较,Gly16/Gly16基因型在房颤组所占比例略大，但未达统计学意义；两组基因型分布中，房颤组Gly16等位基因频率较对照组略小,OR=1.015，说明房颤组暴露在Arg16等位基因者的比例为对照组的1.015倍，但未达统计学意义(见表3)。
表3 房颤组与对照组β22AR基因型分布比较〔例(%)〕组 别n
β22AR基因型①
G ly16/G ly16G ly16/Arg16Arg16/Arg16
等位基因频率②
G ly16Arg16
房颤组557(12.7)34(61.8)14(17.47)48(43.6)62(56.36)
医院院长
对照组639(14.3)38(60.3)16(25.3)56(44.4)70(55.6)
注:①χ2=0.063,P>0.05;②χ2=0.016,P>0.05，等位基因Arg16的OR值=1.015(95%CI:0.809～1.273)
2.3.3 β22AR基因与ACEI/D基因的联合作用分析 将两组的不同基因型联合分为9组，其在房颤组及对照组的分布，所观察两组中，杂合子基因G ly/Arg型+DI 型均占多数，而G ly/Arg型+DD型以及G ly型+DD型的分布在房颤组中明显大于对照组(见表4)。
表4 β22AR基因与ACEI/D基因的联合分布(例,%)
组 别G ly型+
DD型
G ly型+
DI型
G ly型+
Ⅱ型
G ly/Arg型+
DD型
G ly/Arg型+
DI
G ly/Arg型+
Ⅱ型
Arg型+
DD型
Arg型+
DI型
Arg型+
Ⅱ型
房颤组
n42111158365 %7.3 3.6 1.82027.311.5 5.510.99.1对照组
n31542212556 % 4.8 1.67.9 6.334.9197.97.99.5
2.3.5 β22AR基因与ACEI/D基因的协同分布 G ly/ Arg型+DD型及G ly型+DD型在房颤组和对照组分别为15例(27.3%)和7例(11.1%)，两组间的OR=2.455 (95%CI:1.080～5.579)；提示房颤组暴露在G ly/Arg型+DD型和G ly型+DD型基因者的比例为对照组的2. 455倍。非G ly/Arg型+DD型和G ly型+DD型在房颤组和对照组分别为40例(72.7%)和56例(88.9%)，两组相差显著(χ2=5.057,P<0.05)。
3 讨论
3.1 房颤与ACE基因I/D多态性的相关性 众多的研究提示，心房重构是房颤发生发展的重要机制，神经内分泌异常可能是A F心房重构的核心机制，肾素2血管紧张素(RAS)系统和自主神经系统激活是关键。国内外多项研究显示,RASS在心脏重构和房颤发生中扮演重要角〔5～7〕。ACE是RAS的重要组成部分，是调控AngⅡ生成的关键酶，也能催化一些活性肽，在血管张力的调节和血管平滑肌细胞的增生中起作用。众多研究显示,ACE基因D/I多态性与血清ACE密切相关，并能显著影响血浆、细胞的ACE水平和活力，其中D等位基因数目增多与血清ACE浓度呈正比,DD基因型者血清ACE水平为Ⅱ型的两倍，杂合子ID型的则介于两者之间。ACE基因的多态性标志具有明显连锁不平衡，遗传连锁分析研究提示，血清ACE水平在一定程度上受控于单个主基因(major gene)2S等位基因，而非多基因遗传。
并推测S等位基因与ACE基因的第16内含子插入(I)和/或缺失(D)多态性呈紧密连锁不平衡。Terzic 等〔8〕研究认为，当ACE基因第16内含子中有Alu重复序列插入时，即为Ⅱ型ACE基因或I型ACE等位基因时，降低了ACE基因的转录速率，使血清ACE 产生减少，降低了RAS的活力。而D型等位基因中缺乏该序列，致限制性因素消失，血清ACE浓度升高，使RAS较为活跃。也可能由于ACE基因的插入和/或缺失一个287bp序列，造成转录时mRNA的不同拼接，影响mRNA的稳定性，从而调控ACE的表达和分泌；也可能由于缺失287bp序列这一静寂性基元，可导致转录时ACE基因的活化，从而引起机体ACE的高水平。最近的研究〔9〕提示，房颤患者ACE基因DD型及D等位基因的出现频率相对于对照组均有显著的差别(P<0.001)，且OR(DD/ID+Ⅱ)=3.24，认为ACE基因DD型可能是房颤患者的危险致病因素，并认为是ACEI减轻房颤患者发生左室收缩功能不全的机制之一。Yamasita等人亦研究〔10〕认为,ACE(I/D)基因多态性与孤立性房颤不存在相关性。本研究中发现，房颤组和对照组ACEI/D 基因型频率比较,DD基因型在房颤组所占比例较大(53.6%)，但尚无统计学意义(P>0.05)；而D等位
基因分布频率在房颤组中较对照组明显增大,D等位基因OR值为1.646说明房颤组暴露在D等位基因者的比例为对照组的1.646倍，因此我们认为D等位基因可能是房颤的易患基因。
3.2 β22AR+46A→G变异与房颤的相关性 β22AR 是鸟甘酸调节结合蛋白耦联受体家族的一员，属于利用内源性儿茶酚胺，如肾上腺素和去甲肾上腺素为激动剂的肾上腺素能受体家族，该基因编码413个氨基酸，长约1239bp，有7个疏水残基组成跨膜结构域。迄今在β22 AR基因编码区及启动子已
发现有19个单核苷酸多态性(SNPs)，编码区有9个，分别位于+46、+79、+100、+ 252、+491、+523、+1053、+1098和+1239位核苷酸序列，其中+46、+79、+100、+491变异可引起编码氨基酸的改变(错义突变)，从而影响蛋白质功能，其中以+46A →G变异最常见，相应氨基酸置换分别为16位Arg→G ly，研究表明与受体敏感性和血管紧张性有关。近年来国内外的多项研究也证实,β22AR基因多态性与心血管疾病的相关性，其中已证实β22AR+46A→G变异与不同种族的高血压相关，但结果相差较大〔11,12〕。目前国内外未见针对β22AR+46A→G变异与房颤的相关性研究。在本研究结果中，房颤组中β22AR基因为Arg16纯合型14例(17.47%),G ly16纯合型7例(12.7%), G ly16/Arg16型34例(61.8%)，对照组中β22AR基因为Arg16纯合型16例(25.3%),G ly16纯合型9例(1
4. 3%),G ly16/Arg16型38例(60.3%)。房颤组和对照组各基因型及各等位基因分布频率均比较接近，其差异无统计学意义。可能与样本量小有关，并不能完全排除β22 AR+46A→G基因多态性在AF发生中的作用，需扩大样本量进行研究。
3.3 两基因的协同作用分析 由于心血管系统疾病的复杂性，绝大多数心血管疾病是多基因疾病，所以单纯研究某一个基因的多态现象，为疾病发生和发展提供的信息是有限的，然而这也是我们认识问题的一个必经阶段。在对β22AR基因与ACEI/D基因的协同作用研究中，将两组的不同基因型联合分为9组，我们发现杂合子基因联合G ly/Arg型+DI型在房颤组和对照组中均占多数，而G ly/Arg型+DD型和G ly型+DD型的分布频率明显高于其他基因型在两组中的分布频率，有显著的统计学差异,G ly/Arg型+
DD型和G ly纯合型+DD型的OR=2.455；联合基因型患者的房颤比例是对照组的2. 455倍。由此可以推测:β22ARG ly16等位基因与ACEDD基因型的联合是否可能对房颤的发生有一定的潜在影响。目前房颤的遗传方式尚未明确，相关的研究资料也非常有限，它很有可能象高血压及冠心病一样，也是一种多基因遗传病，即它的发病是由多种微效基因协同作用，环境因素共同参与而导致的疾病。我们先从ACE、β22AR两个关键基因入手，逐渐延伸到RASS系统及交感肾上腺素系统中的其它基因，如血管紧张素原基因、肾素基因及血管紧张素Ⅱ受体基因、β12AR (Arg389G ly)、β32AR(T rp64Arg)等，这将对于在分子水平上认识和分析房颤的发病机制具有积极的意义。
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收稿日期:2008202213
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