第32卷第4期2008年7月
水 产 学 报
J OU RNAL OF FISH ERIES OF CHINA
Vol.32,No.4
J uly ,2008
收稿日期:2007206213
资助项目：国家“八六三”高技术研究发展计划(2006AA 10A 402)；山东省泰山学者工程专项资助
作者简介：徐建勇(1982-)，男，山东青岛人，硕士研究生，从事鱼类功能基因组研究。E 2mail :xujianyong 820915@163 通讯作者：陈松林,E 2mail :chensl @ysfri.ac 文章编号:1000-0615(2008)04-497-10
徐建勇1,2, 陈松林1
(1.中国水产科学研究院黄海水产研究所农业部海洋渔业资源可持续利用重点开放实验室，山东青岛 266071;
2.中国海洋大学海洋生命学院，山东青岛 266003)
摘要：采用同源克隆及基因组步移的方法，分离克隆了牙鲆肌肉生长抑制素(MSTN )基因。
经过序列分析及cDNA 验证，牙鲆MSTN 基因具有3个外显子和2个内含子，编码377个氨基酸。5′侧翼区含有8个TA TA 框，一个CAA T 框,6个E 框;3′侧翼区含有加尾信号。通过同源分析，牙鲆MSTN C 末端含有9个保守半胱氨酸残基和一个RVRR 蛋白酶酶切位点；通过进化树分析，牙鲆MSTN 与鱼类MSTN 基因聚为一支。R T 2PCR 分析表明，牙鲆MSTN 在胚胎发育中不表达或表达量较低，说明MSTN 在牙鲆胚胎发育中并不起重要作用；其在各组织中的表达，随个体和环境的不同而有差异，暗示MSTN 的表达受外界因素调控。关键词：牙鲆；肌肉生长抑制素；克隆中图分类号:Q 785;S 917 文献标识码:A 肌肉生长抑制素(myo statin ,MSTN )基因, 又称GDF 8，是转录生长因子(T GF 2
β)家族的成员之一。自1997年在小鼠中发现该基因[1]至今，大量的实验证据表明该基因对哺乳动物骨骼肌的发育和生长有负调控作用，该基因的缺失可导致骨骼肌增生[2]。在小鼠中，通过基因敲除使MSTN 基因C 端生物活性区失活，从而使小鼠的
骨骼肌比普通野生小鼠增加了2～3倍
[1,3]
；在牛和狗中，该基因的自然突变导致的基因失活，使其
肌肉产量增加[4-6]；在斑马鱼(B rachy danio
rerio )中,MSTN 基因的沉默可以导致肌肉数量
和体积的增加[7-8]。到目前为止，除了在哺乳类[9]和鸟类[10]上有MSTN 的报道外，还有大量鱼类MSTN 基因被克隆：斑马鱼[11]
，虹鳟(Oncorhy nchus m y kiss )[12]，大西洋鲑(S al mo
sal ar )[13]
，莫桑比克罗非鱼(Oreochromis
mossambicus )
[14]
，白鲈(M orone americana )[15],
条纹石(M orone sax atilis )[15]，金头鲷(S p arus
aurat a )[16]
，鲶(Ict al urus p unct at us )[17-18]，波纹
短须石首鱼(Umbri na ci rrosa ,Sciaenidae )[19]，石
斑鱼(E pi nep hel us coioi des )[20]，鲈(L ateol abrax j a ponicus )
[21]
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等。通过比对分析发现,MSTN 基
因的蛋白酶酶切位点(RXXR )和C 末端的半胱氨
酸残基在不同的物种中都保持着高度保守[4]。
与其它的T GF 2β家族的成员蛋白一样,MSTN 以前体形式合成后被蛋白酶酶切，形成N
端前肽和C 端活性成熟肽[1,22-23]。酶切之后，前肽与成熟肽仍以非共价结合的方式结合。MSTN 前肽对于MSTN 形成正确的二聚体极其重要[24];MSTN 前肽还可以通过与成熟肽结合，从而抑制MSTN 与其受体结合，阻断其功能[25]。通过转基因表明,MSTN 前肽可以抑制斑马鱼肌肉生长[11]。
在鱼类中,MSTN mRNA 可以在肌肉、眼、脑、肠、鳃、肾、心和脾中发现。尽管不同物种的表达谱存在差异，但在肌肉中都检测到了较高的表达[12-14,16,19,21]。并且在斑马鱼[11,26]、鲑[12-13]，金头鲷[16]，波纹短须石首鱼[19]中都发现了两种类
型的MSTN。MSTN广泛的分布及其不同类型的存在表明，鱼类中MSTN除了参加肌肉的生长和发育调控外，还可能参与机体的其它功能。但到目前为止，鱼类MSTN的功能仍没有完全弄清楚。由于MSTN对生物体肌肉生长的调控作用，人们期望通过对该基因的控制来增加肌肉产量。鉴于MSTN在水产养殖中潜在的应用前景，实验克隆了牙鲆MSTN，并对其进行了初步分析。1 材料与方法
根据不同鱼类MSTN的保守区，设计了两对引物，用于牙鲆MSTN同源克隆。在获得序列的基础上，再设计基因特异引物，用于基因组步移和全长开放阅读框的扩增。引物序列及其用途如表1。
表1 牙鲆MSTN基因克隆及分析引物
T ab.1 Primers for MSTN clone and analysis in Japanese flounder
引物名称primer
引物序列
primer sequence
退火温度(℃)
Tm
用途
国际教育信息化大会
purpose
片断长度(bp)
fragment lengt h
MSTN2-5′5′-CT GCAAA TCTCCCGCCT GA T GCC-3′
MSTN2-3′5′-TCT T GCCGTA GA T GA TCT GCTC-3′56
同源克隆外显子2
和内含子2
1334
MSTN3-5′5′-T GAA GACT T T GGCT GGGACT GGA TC-3′
MSTN3-3′5′-CT T GA GGA T TCCT GGT T TCACT-3′57
同源克隆外显子3
黑泽明的电影风格
和3′U TR
771
狐狸之歌MSTN3W5′-T T GA GGACT T T GGCT GGGACT GGA T T-3′
MSTN3WN5′-AA TCGCAAA GA GCA GA TCA TCTACGGC-3′67
牙鲆MSTN3′端
基因组步移
1414
MSTN5W15′-CCCA GCCAAA GTCCTCAAA GTCAACC-3′
MSTN5WN15′-CCGGCGT TCACGTCAA TCT TCA GGGA-3′67
MSTN5′基因组
第一次步移
青山郭外斜的斜读XIE 还是XIA1112
MSTN5W25′-GGCT GCT GA T GGT GCGTCTCT T GGTC-3′-3′
MSTN5WN25′-CAAACCA TAAA GGGACGCA GACT GT GA GC-3′67
MSTN5′基因组
第二次步移
929
MORF55′-A TCAAACCTCCCACCA GA GAAAA T G-3′
MORF35′-CCGCTACTCT GGT TCTA T T GCAC-3′58
MSTN ORF扩增
及R T分析
1474
J actin2F5′-T GGCA TCACACCT TCTAC-3′
剪辑错了的故事J actin2R5′-CT GCA TCTCCT GCTCAAA GTC-3′60
牙鲆R T分析actin
内参
429
1.2 基因组D NA提取及各组织cD NA制备
取2龄牙鲆活体各组织，液氮速冻后-80℃保存。利用高盐法提取牙鲆肝脏DNA：液氮研磨肝脏组织成粉末后，放入115mL离心管中。然后向每管中加入019mL裂解液(10mmol・L-1 Tris2HCl,400mmol・L-1NaCl and2mmol・L-1 Na2ED TA,p H812),011mL10%SDS和100μg 蛋白酶K,55℃水浴过夜。消化完全后，向每管中加入270μL饱和NaCl(6mol・L-1)，混匀, 12000r・min-1离心30min。将上清转移到一新的离心管中，加入两倍体积无水乙醇沉淀DNA,75%乙醇洗涤一遍，溶于TE备用。
选取牙鲆胚胎发育中的囊胚期、原肠期、尾芽初期、尾芽末期、心跳期和出膜期胚胎，保存于-80℃备用。选取3月龄饥饿1个月牙鲆个体、6月龄正常饲养牙鲆个体和2龄饥饿1周牙鲆个体的性腺、脑、肌肉、心脏、肠、肾、肝、脾、眼、鳃、血液等组织，保存于-80℃备用。利用Trizol (Invit rogen)法提取牙鲆各组织RNA，具体操作步骤按照Trizol说明书进行。用MMLV (p romega)反转录酶的随机引物法合成cDNA第一链，具体操作步骤按照说明书进行。
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1.3 克隆及测序
PCR按照普通程序进行，退火温度按照表1中进行，延伸时间按照预期片段设定(1kb需1min)。基因组步移依照Genomwalker Universal Kit(Clontech)说明书进行。所有PCR反应均在P TC2200型PCR仪上进行。
PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳纯化后，用Q IA EXⅡGel Ext raction K it(Q IA GEN)凝胶回收试剂盒回收。将回收的产物按照摩尔比3∶1的比例与PBS2T(天为时代)载体连接，并将连接产物转化感受态细胞D H5α。利用载体测序引物进行菌液PCR，筛选阳性单克隆送上海联合基因公司测序。
1.4 序列分析
利用DNAMAN软件去除载体序列，按照序列比对和GT2A G内含子外显子规则剪除内含子。利用M EGA311构建进化树。各基因G enbank序列号为：斑马鱼G DF11(NM_212975)，恒河猴G DF11(XM_001096135)，挪威鼠GDF11 (XM_343148)，家鼠GDF11(MM GDF11S03)，狗GDF11(XM_843265)，沟鲶MSTN(A F396747)，鸡MSTN(A Y448007)，银鲑MSTN21(A Y434465)，银鲑MSTN22(AF394687)，河豚MSTN21 (A Y445322)，河豚MSTN22(A Y445321)，家鼠MSTN(NM_010834)，人MSTN(AF019627)，莫桑比克罗非鱼MSTN(AF197193)，虹鳟MSTN21 (AF273035)，虹鳟MSTN22(AF273036)，黄鲷MSTN (AAX82170)，带纹白鲈MSTN(AF290910)，斑马鱼MSTN21(A Y258034)，斑马鱼MSTN22(A Y687474)。
2 结果
2.1 牙鲆MSTN基因克隆及特征
通过两对MSTN保守区引物的扩增及基因组步移，获得了牙鲆MSTN全长基因组DNA序列，并通过基因特异引物在牙鲆cDNA中验证了开放阅读框的正确性。最终获得了4932bp的基因组序列，其中包括1340bp5′侧翼序列,382bp 的外显子1,361bp内含子1,371bp外显子2, 757bp内含子2,381bp外显子3,1340bp3′侧翼序列。开放阅读框共长1134bp，编码377个氨基酸(图1)。5′侧翼区含有8个TA TA框，一个CAA T框,6个E框(MyoD结合位点, CAXXT G)。在很多物种中发现的位于加尾信号和多聚A间的保守序列(YGT GT T YY)，也在MSTN3′端存在[27]。
2.2 牙鲆MSTN蛋白比对及进化树构建
经进化树分析(图2)，牙鲆MSTN与鱼类MSTN紧密聚为一支，而与其高度同源物GDF11同源性较远，说明我们克隆得到的基因属于MSTN基因。通过Clustal X蛋白序列比对发现(图3)，牙鲆MSTN拥有9个保守半胱氨酸残基和RXXR蛋白酶酶切位点，并具有保守的C末端。牙鲆MSTN与其它物种的同源性为：人6415%，家鼠6315%，鸡6415%，斑马鱼Ⅱ型6515%，斑马鱼Ⅰ型8011%，虹鳟Ⅱ型8315%，虹鳟Ⅰ型8415%，白鲈9216%，黄鲷9015%，沟鲶7715%。通过同源性数据，发现牙鲆MSTN基因与斑马鱼和虹鳟的Ⅰ型MSTN较为接近，说明我们克隆的牙鲆MSTN应该属于Ⅰ型MSTN。2.3 牙鲆MSTN R
T2PCR分析
对牙鲆不同发育时期，及不同个体的不同组织进行了R T2PCR分析,PCR产物经测序证明无非特异产物或交叉扩增。用于扩增内参的actin 引物，在设计时跨越了一个内含子序列，所以在表达时可以用来检测是否有DNA污染(图42A)。在胚胎发育中，没有检测到MSTN的表达(图42 B)。在3月龄长期饥饿个体(不投饵饲养1月，其余条件与正常相同)组织中(图42C)，在脑和肾中的表达最强，在肌肉和眼中的表达次之，在脾中没有检测到表达。在6月龄正常饱食鱼体(正常饲养)组织中(图42D)，在肾和眼中检测到了较强的表达，在肌肉中的表达次之，在脑、肾、脾和鳃中都检测到了非剪切转录本，在心脏和肝中没有检测到转录本。非剪切状态的转录本经过测序得到证实。在2龄短期饥饿鱼(不投饵饲养1周，其余条件与正常相同)组织中(图42E)，在脑中检测到了较强的表达，而在肾和肌肉中仅检测到了微弱的表达。
3 讨论
克隆分离得到的牙鲆MSTN基因与其它物种的MSTN具有较高的同源性，特别是其C端活性功能区。牙鲆MSTN拥有3个外显子和2个内含子，编码377个氨基酸。推定的蛋白质拥有RXXR蛋白酶酶切位点和9个保守半胱氨酸残基，与其它物种的MSTN特征相同[4,28-29]。其5′侧
994
4期徐建勇，等：牙鲆肌肉生长抑制素(MSTN)基因克隆
图1 牙鲆MSTN 基因序列
TA TA 盒(TA TAA )用框字表示,CAA T 盒(CCAA T )用下划线表示,E box 用框字加阴影表示,
加尾信号(AA TAAA )用波浪线表示。加尾信号和多聚A 间的保守序列(YGT GT T YY )用短下划线表示
Fig.1 The Sequence of MSTN
TA TA box (TA TAA )was framed ,CAA T box (CCAA T )was underlined ,E box was framed and shadowed ,poly A signal was waved ,t he conserved sequence between polyA signal and polyA was indicated wit h (___)
005水 产 学 报32卷
图2 牙鲆MSTN进化树分析
Fig.2 Phylogeny tree of J apanese flounder MSTN
翼区拥有8个TA TA框、一个CAA T框和6个E框，类似于在斑马鱼和溪红点鲑(S al veli nus f onti nalis)上的报道[11,30]；其3′端含有加尾信号。通过同源性分析和进化树分析，牙鲆MSTN基因与鱼类MSTN
基因有较高的同源性，说明了该基因属于MSTN基因并且应该归属于Ⅰ型MSTN。通过序列分析，发现来自脑和肌肉的MSTN基因具有两个SN P位点(Genbank Accession No.EF668005,EF668006)，一个发生在编码区，为同义突变；另一个发生在3′非编码区。
用于MSTN表达的引物，跨越整个编码区，而且还可以通过PCR产物片段的大小区分转录本的加工状态。如果表达产物与预期cDNA长度相符，则说明转录本内含子均被剪切；而如果表达产物与预期DNA长度相符，则说明转录本处于未剪接状态，内参actin可以检测是否有DNA 污染。在胚胎发育中，没有检测到MSTN的表达(图42B)，说明MSTN在牙鲆胚胎发育过程中并不起重要作用，类似的结果也在虹鳟中发现[31]。MSTN在牙鲆脑中有大量表达(图42C,D,E)，说明MSTN在鱼类神经发生中起着重要作用[31]。其在肾脏中的高表达(图42C,D)，暗示着其在免疫方面的潜在功能[32]。在肌肉中虽然检测到了表达，但其表达量较低(图42C,D,E)。有研究表明，长期禁食可降低幼鱼MSTN的表达，短期禁食可增加幼鱼MSTN的表达，而长期禁食对成鱼却没有影响[33]。实验选择了不同时期，不同状态的鱼体进行了表达分析(正常饱食，短期饥饿1周，长期饥饿1月)，发现不同状态下，其表达图谱和表达强度各有不同(图42C,D,E)，说明MSTN 的表达受外界营养状况的影响。长期饥饿3月龄幼鱼的成长受到明显阻碍，其肌肉MSTN表达水平较正常有降低的趋势(图42C和图42D中肌肉MSTN表达量与actin表达量对比)；而短期饥饿的2龄成鱼也有下降的趋势(图42D和图42E 中肌肉MSTN表达量与actin表达量对比)。在正常养殖的个体中，发现存在非剪接的转录本(剪接长度约1270bp，非剪接长度约214kb) (图42D)。处于非剪接状态的转录本经测序证明其
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