余磊，邱小忠，廖华，秦建强，黄美贤，戴景兴，欧阳钧，赵卫东
南方医科大学临床解剖学研究所，广东省组织构建与检测重点实验室，广东省广州市)&")&)
余磊，女，&*#+年生，江西省南昌市人，汉族，!""!年解放军第四军医大学毕业，实验师，主要从事组织工程研究。
通讯作者, 赵卫东，助理研究员，南方医科大学临床解剖学研究所，广东省广州市)&")&)
广东省专项课题-./"!"!"0"&1(2广东省科技攻关项目-!34"))"/56(2广州市科技攻关项目7!""!8&$9""/%6(璃粉吸附法扩增人静脉血中的线粒体氧化酶亚基!基因片段。$通过V D?S I?_数据库，采用“d G I@A”的方法进行相似性数据搜寻，选择合适的&# 种灵长类生物氧化酶亚基!基因的#+# 碱基序列片段；采用X.PX 0^" b].序列分析软件进行分析。结果："利用玻璃粉吸附法成功扩增出了人的氧化酶亚基!全基因片 段，并对扩增片段进行了序列分析。$根据序列测定结果，结合生物信息学技术研究&# 种灵长类动物之间的分子进化关系，建立了新的分子进化树，其中一致性指数为"^)#"+，相似性指数为"^0/*!。 结论：线粒体氧化酶亚基!基因片段可以作为进化分析的分子指标。主题词：b].，序列分析；计算生物学；细胞素’类；还原氧化酶类；进化，分子
中图分类号,:/*0文献标识码,.文章编号,&#%&$)*!#-!""#6!)$"&"!$"0收稿日期,!"")$&!$!"修回日期,!""#$"/$&#-")$)"$&"$%*%%;<·=6
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人类线粒体b].（J A b].）是一条&# )#*SZ 的双链环状b].分子，编码&/条多肽链，每个细胞中有几百甚至上千个线粒体，并且每个线粒体中有!e&"个拷贝的J A b].，人类的J A b].是严格的母性遗传，在各组织中是随机分配的，并且在细胞分化过程中随机分隔。在同一细胞中可能同时存在不止一种类型的线粒体b].（野生型和突变型）由于J A b].的突变具有组织的差异性，从而导致焦点式（F EH I G）或镶嵌式
（J E@I B H）的组织化学或生物化学缺陷f&g。
在生物系统和个体发育中，J A b].受到日益频繁的氧应激攻击，因此氧应激导致的b].突变在生物系统发育和个体发育中扮演着重要角，J A b].
是研究各种生物特别是灵长类动物中最常用的分子指标之一，在物种进化过程中，J A b].是突变率很高的b].f!$0g。
细胞素’氧化酶是由线粒体和核b].共同编码的，其反应活性中心细胞素’氧化酶亚基!是由线粒体b].编码的，氧化酶亚基!在线粒体细胞素’的产生和释放中扮演重要角，细胞素’的释放和细胞凋亡密切相关f)g，不断受到氧应激攻击的氧化酶亚基!基因及其表达产物在生物进化过程中的突变率是一个非常值得探讨的问题，有研究表明尽管起重要功能作用的部分氨基酸在所有的灵长类中是保守的，在细胞素’氧化酶亚基!中仍然存在许多相对保守和氨基酸变化较大的部位，在线粒体基因组编码的细胞
素’氧化酶亚基!是有胎盘动物中氨基酸残基的替换速率最高的蛋白质之一f#g。在高等灵长类动物中，氧化酶亚基!蛋白质结构的变化将导致其本身和细胞素’相互作用的物理性质的改变，有人利用氧化酶亚基!氨基酸序列的比较分析表明氧化酶亚基!的氨基酸残基的更换主要集中在高等灵长类，并
密籍
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B+$@-)#""M N!"O#$PQ!"#R$O J1)2-P 余磊，邱小忠，廖华，秦建强，黄美贤，戴景兴，欧
阳钧，赵卫东L灵长类细胞素J 氧化酶亚基!基因的进化分析S5TL中国临床康复，#""M，!"O#$PQ!"#R$
S UUU L03B I V E L I.H T
摘要
目的：利用玻璃粉吸附法扩增人静脉血中的线粒体氧化酶亚基!基因
片段L对灵长类氧化酶亚基!基因进行分子系统学分析。
方法：实验于!""/$"/;!""0$&"在南方医科大学解剖教研室完成。%玻
& % ( , N * $
)-$ D 7
$i PQK R ?5J45；*j &：微量 P QK 扩增的聚合酶链反应产物
图 $ 玻璃粉吸附法扩增出 +c * 全基因片段（)-$ D 7）
认为大多数改变是在新大陆猴类中发生0&1。
本实验利用生物信息学技术对 $% 种灵长类动物 （2345678934:;< =4>?@?， A?786 3?B ?@5C ?<
，+45:6:4D ;< =?>4589;<，+45:678934:;< ?493867<，E ?:?:? F ?<:8:;>?58<， （体 积 分 数 为 -I (( 的 乙 醇 ，]- BB 6> . ‘ +a N +ccd ，
], BB 6> . ‘ 258<M a +> Z 7a &I ([，,- "B 6> . ‘ 乙二胺四乙 酸）洗 * 次，离心 $ B 8G . 次，晾干后直接用 (- "‘ 的聚 合酶链反应液 （包括 $e A +/ D ;FF 45、, 种 @Q2A < 以及 上、下游引物）悬浮沉淀物，直接使用或于 , f 保存不 超过 *, 3。
取含有吸附 PQK 玻璃粉的 (- "g 的聚合酶链反 应液，), f 变性 , B 8G 后，加入 $V 的 2?O PQK 聚合 酶，按程序（), f $ B 8G ，(- f $ B 8G ，&* f * B 8G ）循
环反应 N - 次。产物进行 $- = . g 琼脂糖凝胶电泳，拍照 分析。聚合酶链反应产物纯化后直接用于序列测定（委
托上海联合基因公司完成）。
生物信息学分析：利用 H 4G D?G J 数据库，按照人 的细胞素 + 氧化酶全基因序列，利用 XXXI G :D 8I G >B I G 83I =6Y . A ;D R 4@ 的 W >?<9 基本搜索，搜寻相似性较大的 相关基因片段，选择合适的 $% 种灵长类生物氧化酶亚 基!基因的 %]% 碱基序列片段。利用 AKVA ,I - PQK
序列分析软件进行 PQK 序列分析比较，以蛋白质的起 始氨基酸密码子为参照起点，按照最大同源性
的原则
进行序列排列，为了保证最大同源性，在必要的位点引
入 空 位 （HKA ）， 按 照 最 大 简 约 法 （B ?h 8B ;B 7?5<8B 6GC ），采用 "X 6FF 6@ 的 A KV A ,I - 序列分析软件进 行分析，构建无根树图。按软件约定选择软件中 W 669<95?7 方法的 a 4;58<98: 分析项计算距离系数进行 分析和树图的绘制。利用 K ++2/KQ 进行数据优化。 组成氧化酶亚基!蛋白的氨基酸序列排列以蛋白 质的起始氨基酸为参照起点，按照最大同源性的原则 进行序列排列，为了保证最大同源性，选择氨基段 **$ 个氨
基酸残基进行排序，计算距离系数按照最大同源 性和最近邻法则进行聚类分析和树图的绘制。 主要
观察指标：#人氧化酶亚基!基因片段的扩 增。$$% 种灵长类生物细胞素 + 氧化酶亚基!基因 进化分析。 " 结果
*I$ 人氧化酶亚基!基因片段的扩增 本实验采用
玻璃粉吸附法扩增出了所有 ,( 例老人的细胞素 + 氧化酶亚基!基因片段（)-$ D 7），无须酚的抽提，操作 方便快速，整个过程只需 N - B 8G ，见图 $。
3;B ?G ， HI =658>>?，D >?:J <78@45 B 6G J 4C ，K 94>4< <7I 3?7>69C 74 K F 5$)， +3?B4J <78@45 B 6G J 4C ，K 94>4< D4>L4D ;93，54@M D4>>84@ >4B ;5，B 6G =66<4 >4B ;5，D?B D66 >4B ;5，=5?C B 6;<4 >4B ;5，?C 4M ?C 4）之间细胞素 + 氧 化酶亚基!基因的核苷酸序列进行了比较分析，试图 阐明灵长类动物中细胞素 + 氧化酶亚基!基因的 分子进化过程，进一步了解线粒体氧化应激作用在生 物进化中的地位。 ! 材料和方法 设计：单一样本观察。
单位：南方医科大学解剖教研室。 材料：实验于 *--N ’-N . *--,’$- 在南方医科大学 解剖教研室完成。试剂：2?O PQK 聚合酶、*I ( BR @Q2A < 购自上海 "?G =6G 公司，玻璃粉购自美国 "8=B ? 公司， 聚合酶链反应产物纯化试剂盒购自 S T KHUQ 公司，其 余各种生化试剂及有机试剂均为国产分析纯产品。仪 器与软件：带 R ?:3 N I - 操作系统的苹果机、AKVA ,I - PQK 序列分析软件及相关软件由中山大学生命科学 学院施苏华教授提供。W >?<9 基本搜寻及比较分析软件 由网站“XXXI G :D 8I G >B I G 83I =6Y . A ;D R 4@”免费提供。 设计、实施、评估者：设计为第一、二作者，实施为 全部作者，评估为第七作者。
方法：
人细胞素 + 氧化酶亚基!基因片段的扩增与 序列分析：,( 例健康老人的外周血Z 来自解放军第 一军医大学老年干休所，,( 例健康老人均知情同 意[。从微量外周血中提取痕量 PQK \]^，用于聚合酶链 反
应扩增目的基因片段，根据 W58@=45 线粒体 P #K 序列合成引物\$1：细胞素 + 氧化酶亚基! （_ ）(’M +KK H++ KK+ +++ K2H H++ 2++M N ’，细胞素 + 氧化酶亚基!（’）(’M KH2 K22 2KH 22H HHH +K2 22+ K+ M N ’。 指头采血约 $-- "‘，溶解于 N -- "‘ 的 & = . ‘ 乙 二胺四乙酸溶液中，置于’*- 冰箱中保存。将玻璃粉悬 于 ( 倍的 2U 缓冲液（$- BB 6> . ‘ 258<I +>，$ BB 6> . ‘，乙 二胺四乙酸 7a ]I -）中，充分混匀后待用。取冰冻保存 的 $- "‘ 乙二胺四乙酸稀释血样，加入盛有 $-- "‘ 2U 缓冲液的 -I ( "‘ 的微量离心管中，用相同体积的 氯仿：异戊醇（*, b $）抽提 $ 次，$- --- : 离心 $- B 8G 后，将上清液移入另一管中，采用 N 倍体积的 % B 6> . ‘ 碘化钠将 PQK 变性，再加 $ "‘ 的玻璃粉吸附 PQK ， 充分混匀约 $- B 8G 后，] --- : 离心 $ B 8G ，洗脱液
宾果豆豆
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+I3?1I3++J%%%%%J++++J+JJJJ H+++++J H+??JJ+%J++%J+J+JJ+J++图! =$ 种灵长类氧化酶亚基!基因部分片段的碱基排列
24D1F Q$R
=77 .230-(5.2364/G3CQ=R
:$(1(5-21D1B0I1/Q!R
$= 6306-63’4/G1C305Q9R &!
6306-(5.2364/13.Q;R
E16161L1/6564C10Q:R
’C16M/(5B30Q&R
<9 =77 1.3C3//(Q<R
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621D3M/(5B30Q=7R
’3C N3’4.2D10G5F1Q==R
=77
=77
03B’3C C53B C3D40Q=!R
<;D-F G--/3C3D40Q=9R
$9 ’1D’--C3D40Q=;R
<< H01I D-4/3C3D40Q=:R
1I31I3Q=$R
GG-05C C1Q S R
图9 =$ 种灵长类生物细胞素% 氧化酶亚基!基因分子进化树
基酸密码子为参照起点，#$ 种灵长类生物氧化酶亚基!基因的$&$ ’(碱基序列片段，进行排列组合，部分)*+ 序列见图!；)*+ 序列间的距离系数矩阵见表#。见图9，其中一致性指数为8":$8&，相似性指数为8";9<!。
! 讨论
玻璃粉吸附法能够很好地吸附痕量的血液)*+，并对于一些难于获取的样品有独到的优点，=88 ">微量的血液结合玻璃粉吸附法可以进行;8多次的聚合酶链反应分析，非常方便，有利于实验的重复性操作和多个基因片段的获取。此外，玻璃粉吸附法还可以用于痕量的精液)*+ 分析，为)*+ 痕量检测提供有力的工具。
按照自由基?线粒体衰老假说，裸露的线粒体)*+ 处在活性氧不断产生的氧应激环境中，线粒体)*+ 及蛋白质（包括线粒体)*+ 编码的和核)*+ 编码的）都不断地受到氧自由基的攻击，因此在生物进化中线粒体)*+ 碱基突变率及蛋白质的氨基酸替换率应该是很大的。线粒体)*+ 的进化速率非常高，是核)*+ 进化速率的=8@!7倍，这些特点导致不同种间甚至不同个体间的线粒体)*+ 的一级结构都可能有所不同，本实验结果显示，#$ 种灵长类动物分属于；个族：狐猴族（包括A3B ?’3CC53B C3D40、E-F G--/3 C3D40、,1D’--C3D40、H01I D-4/3C3D40、+I3?1I3等：种动物）、类人猿族（24D1F 和H"G-05CC1）、古域猴族（J230-(5.2364/G3C1B1，K1(5-21D1B0I1/，%306-63’4/ G1C305.4/，%306-(5.2364/13.25-(/，E16161L1/6564C105/）和新域猴族（’C16M/(5B30D-F M3I，+.3C3//("，%21D3M /(5B30D-F M3I，+.3C3/’3C N3’4.2），这和J1M121.1的观
表)): 中灵长类动物氧化酶亚基!基因HL0 序列间的距离系数矩阵（:4:PU）
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点是一致的657。
本实验结果显示，除其中一个属于狐猴属的c N BR .M V CG A G.V N Z)([和其他- 个不同种间的差异都大于33d外，e G]f P G AAT G]A G.V N IO MQ a MMCG A G.V N和@B.P MM A G.V N等狐猴属内各种类间的氧化酶亚基!基因变化都小于3%d，建议将c N BR.M V CG A G.V N从狐猴属中分离出来。
# 参考文献
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颌位关系的最终确定：选择比值接近)&*即髁状突位于关节凹中央状态下的颌位关系为最终的颌位关系。如果原有咬颌状态、垂直距离升高+，,，-..的咬颌关系中有, 种均为居中关系，则选用! / 0 值最接近)&%的一种。颞颌关节1 种咬颌关系2 线片及对应描记图见图3。
义齿的完成：按确定的最终颌位关系常规上颌架制作暂时义齿。试戴) 周，若无任何不适感觉再进行永久性修复。
主要观察指标：患者咬颌重建的颌位关系情况。
! 结果
,&)咬颌重建的颌位关系情况14 例患者中，1%例原咬颌关系状态下髁状突位于关节凹后位，其中)4例升高) .. 后髁状突居中，)(例升高3 .. 后髁状突居中，5 例升高- .. 后髁状突居中。另外4 例患者原咬颌关系状态下髁状突位于关节凹中央，其中- 例升高) .. 后仍然为居中关系，(例升高) .. 后髁状突位于关节凹前位。
3&3义齿的完成情况按髁状突居中状态下的颌位关系制作义齿，其中( 例患者升高) .. 后关节凹位于前位，未改变其颌位关系只将影响修复的对颌牙进行牙髓，调磨其牙冠高度后进行义齿修复。
倾慕系列" 讨论
颞颌关节骨性关系与颌之间有着密不可分的关系，可视为一功能整体。国内外许多学者曾就颌与颞颌关节关系及2 线检查方法做过大量研究，证明正中颌位时髁状突位于关节凹的中央6)，37。对天然牙、部分缺牙和无牙颌需咬颌重建时应建立一个更符合生理要求的下颌对上颌的位置关系，即髁突应在关节凹的中央，这正是本实验的理论依据。
颞颌关节终生不断改建，其发生可能与颌改建有关，在一定范围内被认为是对新颌关系的功能性适应；
改建如超过一定范围可产生病理变化。颌降低使髁突发生退行性改建，颌升高使髁状突发生进行性改建。患者短时间内对这种轻微改变会有很大的适应性，不会察觉，但长时期使用会产生病理性变化，进而引起颞下颌关节紊乱综合征。对需要进行咬颌重建的患者，在修复过程中，医生几乎完全凭借其临床经验，根据患者的解剖标志、咬颌习惯这些非生理性指标来重新确定颌位关系，许多患者和医生均认为满意的修复体却使患者颞颌关节的骨性关系发生了变化。长期使用会产生病理性疾病，最终引起颞颌关节疾病。本实验利用颞颌关节骨性关系测量对需要进行咬颌重建的患者确定颌位关系，14 例患者分别拍摄原有咬颌状态、垂直距离升高)，,，-.. 颞颌关节2 线片并进行描记，通过描记出的关节间隙前、后腔面积的比值，选择比值接近)8%即髁状突位于关节凹中央状态下的颌位关系为最终的颌位关系。实验结果表明应用颞颌关节骨性关系测量为需要咬颌重建的患者确定颌位关系的方法客观而可靠。
（图)，，见插图,(91页）
参考文献
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