Research paper研究论文
22 January 2021, 40(1): 95-107 Mycosystema ISSN1672-6472 CN11-5180/Q DOI: 10.systema.200119
与蝉花有关的虫草菌生物多样性的研究I h重要药 用真菌蝉花有性型的发现及命名 李增智1>4°栾丰刚2H Y W E L-JO N E S N igel L1张胜利1,3陈名君4
黄勃4孙长胜1陈祝安1李春如1谭悠久1董建飞1
O浙江泛亚生命科学研究院浙江平湖314200
©江西农业大学林学院江西南昌330045
©亳州学院生物工程研究所安徽亳州236800
O安徽农业大学教育部真菌生物技术工程研究中心安徽合肥230036
摘要：我国重要药用真菌蝉花的分类地位和学名在国内外长期混乱，因其有性型未被发现，长期以来
误作为根据巴西标本命名的/5ar/a(Paec//om yce5)cZcadae。作者最近在井冈山发现了其有性型，研究了标
本及分离物的形态特征及多位点系统发育特征，并与G e n B a n k中相关种类的序列进行了对比，证明/. c/c a d a e是物种复合，确定蝉花是虫草科虫草属中的新种，使用传统药用真菌蝉花的古老名称将其命名
为Cordyc印s ch anh u a。姆花子座淡橙到淡結黄，子囊壳半埋生，475-602x222-319(im，子囊孢子246-360x1.5-1.8p i m，分孢子圆筒形，6.4-13.8x2.1-3.1n m。孢梗束淡黄至淡黄褐，分生孢子长捕圆
形或圆筒形，3.5-10.5x1.5-4.5n m。
关键词：蝉花，有性型，蝉棒束孢，复合种，系统发育
[引用本文]李增智，栾丰刚，HYWEUIONES Nigel L，张胜利，陈名君，黄勃，孙长胜，陈祝安，李春如，谭悠久，董建飞，2021.与蝉花有关的虫草菌生物多样性的研宄I I：重要药用真菌蝉花有性型的发现及命名.菌物学报，40(1): 9S-107
Li 11,Luan FG, HYWEL-JONES Nigel L, Zhang SL, Chen MJ, Huang B, Sun CS, Chen ZA, Li CR, Tan YJ, Dong JF, 2021. Biodiversity of cordycipitoid fungi associated with Isaria cicadae Miquel II: Teleomorph discovery and nomenclature of chanhua, an important medicinal fungus in China. Mycosystema, 40(1): 95-107
o Corresponding author. E-mail: *************
ORCID: LI Zeng-Zhi (0000-0002-9606-5030)
Received: 2020-04-12, accepted: 2020-08-06
Copyright © 2021 Institute of Microbiology, CAS. All rights reserved. |********** Http://journals-myco.im.ac Tel: +86-10-64807521菌物学报95
李增智等/与蝉花有关的虫草菌生物多样性的研究II：重要药用真菌蝉花有性型的发现及命名Research paper Biodiversity of cordycipitoid fungi associated with Isaria cicadae Miquel II: Teleomorph discovery and
nomenclature of chanhua, an important medicinal fungus in China
L I Z e n g-Zhi1,4° L U A N F e n g-G a n g2H Y W E L-J O N E S Nigel L1Z H A N G S h e n g-Li1，3
C H E N M i n g-J u n4H U A N G B o4S U N C h a n g-S h e n g1C H E N Z h u-A n1L I C h u n-R u1
T A N Y o u-Jiu1D O N G Jian-Fei1
©Zhejiang BioAsia Life Science Institute, Pinghu, Zhejiang 314200, China
©Forestry College, Jiangxi Agricultural University, Nanchang, Jiangxi 330045, China
©Institute of Bioengineering, Bozhou University, Bozhou, Anhui 236800, China
金熙俊内蒙古地勘十院©Research Center of Fungal Biotechnology, Anhui Agricultural University, Hefei, Anhui 230036, China Abstract: T h e systematic position a n d scientific n a m e of"c h a n h u a",a n important cordycipitoid m u s h r o o m has long b e e n chaotic.B e c a u s e i t s t e l e o m o r p h w a s u n k n o w n,i t has long b e e n regarded as Isaria (Paecilomyces) cicadae n a m e d b a s e d o n a Brazilian s p e c i m e n.T h e t e l e o m o r p h of this taxon w a s recently discovered f r o m M t.J i n g g a n g s h a n,Eastern C h i n a.In the present p a p e r,the t e l e o m o r p h a n d a n a m o r p h of the species w e r e studied morphologically a n d m u l t i g e n e-phylogenetically,the hypothesis that/.cicadae w a s a species c o m p l e x w a s d e m o n s t r a t e d,a n d"c h a n h u a"w a s verified as a n e w species in the g e n u s Cordyceps of Cordicipitaceae a n d t h e n Cordyceps cha
nhuo w a s p r o p o s e d using the ancient Chinese n a m e "c h a n h u a"as its epithet.S t r o m a t a of C.chanhua are light o r a n g e to light saffron,o v oid, 476-602x222-319|i m;ascospores are filiform,246-360x1.5-1.8^im a n d part spores are 6.4-13.8x2.1-3.l^i m.Conidia are long ellipsoid or cylindrical, 3.5-10.5x l.5-4.5^i m.
Key words: C o厂c/yceps c h a n h i/a,t e l e o m o r p h,/scfna c/.c a d a e,species c o m p l e x,phylogeny
长期以来，我国重要药用真菌蝉花的分 类地位及名称一直处于混乱状态。当前学界 多认定蝶花是M i q u e l1838年依据巴西标本 命名的/sar/a c/ccrcfae M i q u e l，对二者形态的 差异颇欠考虑。因蝉花的有性型一直未发现，因而也影响对其分类地位的判断。过去 或现在都有人将C o r d y c e p s c/cactoe M a s s e e (M a s s e e1895)视为/•c/cactoe的有性型而采用 (W u e f a/,2019; Z h a e t a/.2019)；因受日本文 化影响，它曾被当作小蛛草Op/?/ocordyceps 5〇b o///e r a的无性型而被称为Corc/yceps sobo/，/era (蔡邦华1957；刘波1974)；它也曾 被当作大蝉草（地方名“独角龙”）的无性型 Cordyceps cicadae Sb\ngi=Tolypocladium duj/a o/o n g a e Y.P.C a o&C.R.Li)之名（幸兴球 1975；梁宗琦2007)；此外，还有人提出蝉 花是小林虫草 C o r d yceps/f〇bcryas/7Koval 的无 性型（Z h a e t c r/. 2018)。在 G e n B a n k 中，虽 有众多菌株的I T S序列及两个菌株的5基因 序列，但材料皆为无性型。在/S W/C7属被证 96菌物学报
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明是虫草科中的一个多系的类（代永东等2016)后，它在系统发育中己无独立位置。
我国学界寻蝉花有性型多年，直到 2015年7月13日才在江西井冈山发现。有 些标本上同时存在有性型和无性型，无性 型形态与我国南方各地采挖的药用蝉花一致，符合笔者以婢棒束孢/sar/a c/cadae M i q u e l之名的详细描述（李增智等2014)，但与M i q u e l(1838)原描述的孢梗束极其简单的/.c/c a d a e大相径庭。对井冈山标本 及分离物的形态学、分类学和分子系统学研宄，不仅有助于确定蝉花的分类地位，而且有助于辨明被认为世界广布的巴西种/.c/'c a d a e的多样性、复合性及在世界各地可能隐含的种类。
1材料与方法
1.1形态学研究
有性型描述依据寄主标本，无性型描述 则根据纯培养物上的产孢结构。
1.1.1供试标本：感染虫草菌的竹蝉
P/aty/om'.a p/e"_Kato共 7 只。J G S150713 号共5只，均在毛竹林中采集，其中1只(J G S150713-1)同时具有子座和孢梗束；J G S150725号，共2只，均同时具有子座和 孢梗束。
1.1.2供试菌种：B A I C1273号，从标本J G S150713-1子座分离。纯化后点植到
C zapek-
D o x和P S A培养基上，26°C下培养14d。
1.2系统发育研究
1.2.1 D N A提取、I T S序歹I J和5基因序列扩增及测序：有性型直接切取子座，采用无菌水 冲洗后，采用C T A B法（刘少华等2005)提 取总D N A。无性型采用组织块分离法，切取 部分孢梗束，接种至S D A Y培养基，待菌丝 长出后挑取菌落边缘菌丝纯化镜检后，接种 至铺有玻璃纸的S D A Y培养基上，培养5d后，刮取菌丝采用C T A B法提取基因组D N A。对 ITS序列及 L S U、S S U、R P B1、R P B2 和 T E F等
5个基因片段进行P C R扩增和测序。参考 W h i t e e t a/.(1990)的方法选择 ITS4/ITS5 用
于扩増 ITS；参考 Vilgalys &S u n(1994)的 方法选择L R0R/L R5用于L S U、N S1和N S4 用于扩增 S S U；参考 Castlebury e t a/. (2004) 的方法选择R P B1A/R P B1C用于扩增R P B1;
参考 Rojas e t a/.(2010)的方法选择 R P B2-5F/ R P B2-7CR用于扩增 R P B2；参考 R e h n e r& Buckley(2005)的方法选择 983F/2218R用 于扩增 T E F。采用 P C R M a s t e r M i x(P r o m e g a)
的50叫体系，P C R反应条件参考相应文献
进行，依据P C R结果对退火温度进行适当
调整。扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳检
测合格后送生工生物工程（上海）股份有限 公司测序。
1.2.2多位点系统发育分析：为确定井冈山 标本的确切分类地位，参考S u n g et a/. (2007)、代永东等（2016)和 M o n g k o l s a m r i t a
e t a/. (2018)的报道，从G e n B a n k选取标为 Cordy c e p s c/_c a d a e的4个菌株和1个标为 /sar/a c/c a d c r e的菌株的I T S位点和其他5基 因位点序列，G e n B a n k中唯一的/sar/'a s/n c/a/r//菌株的I T S序列，以及虫草属
C o r d y c e p s的其他22个分类单元的23个菌 株（C.ya/cayan/c o/a有2个菌株）的丨T S位点 和其他5基因位点序列进行多位点系统发育 分析；为进一步澄清蝉花与曾被误认的小蝉 草0. s o b o///e r a和
氨基甲酸酯大蝉草（现称独角龙弯颈 霉）7"_d(//7a o/o n g a e(幸辛球 1975; L i ef 〇/•2018)的系统发育关系，也选取了它们及线虫 草科冬虫夏草 O p/i/ocorc/yceps s/nens/s 各一个 菌株的多位点序列。采用M U S C L E V3.8.31 (E d g a r2004)对6个位点进行多序列比对，对每个位点的序列矩阵校对后，使用 S e q u e n c e M a t r i x 1.8 的方法（Vaidya ef a/.
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李增智等/与蝉花有关的虫草菌生物多样性的研究II：重要药用真菌蝉花有性型的发现及命名Research paper
2011)对I T S和5个基因序列进行拼接并导出 序列矩阵。
数据集包括30个分类单元的38个菌株 (含外及井冈山材料），157条D N A序列 的6位点矩阵，其中ITS723b p、L S U911b p、S S U 1 295b p、R P B1 698b p、R P B2 1 016b p 和 T E F968b p；序列总长度达5 611b p(表1)，1 776个独特模式，其中3 696个恒定点，1518个简约信息点，397个单碱基差异点。使用 IQ-TREE(M i n h e t a/. 2020)软件包，采 用最大似然法（R e h n e r&Buckley2005)，以肉座菌目丛赤壳科朱红丛赤壳A/eciT/_a c/_/i/i a b a/7_n a作为外，构建M L系统发育树。最大似然法用1 000次重复获得自举支持率，同时选用超快自展和1 〇〇〇次S H-a L R T 检验估算节点的可信度。经丨Q-T R E E计算，得到联合基因的贝叶斯信息准则（B I C)最适 模型为：
T I M3+F+G4。酷网站
2结果与分析
2.1多位点系统发育分析
30个分类单元的38个菌株的6位点系 统发育分析所获得的M L系统树（图1)清 楚地显示，井冈山的蝉花标本（j G S150713-l T E L)和分离株（j G S150713-l A N A)与浙江泛亚生物医药的蝉花生产菌株B A001以100%的支持率形成虫草科里的一个单独分支。B A001的全基因组序列已由该公司测定，并于2011年3月16日使用P.c/_c a d a e之名在香港发布。因此，这一分支的多位点序列 和G e n B a n k上的全基因组序列（检索号：P R J N A53245)典型地代表了我国古老的药用 真菌蝉花的D N A特征。
从系统树中可见，历史上曾被误认为是 蝉花的小蝉草和大蝉草（独角龙弯颈#)都 不属于蝉花所在的虫草科。小蝉草属于线虫 草科，而大蝉草（独角龙弯颈霉）则不仅不属于虫草科，而且还有可能不属于线虫草科，需 要进一步研宄确定。
在系统树中，蝉花分支与其他己见诸报 道的C.c/'c a d a e菌株分开。与该分支最近的广 西猫儿山菌株 C.c/cadae RCE F H P090724-31 (Kepler e t a/. 2017)支持率为82%，与代永 东等（2016)报道的云南菌株Y H I C Y Y 101的关系甚至远于子囊孢子形态截然不同的泰蝉 虫草 Cordycepsycf/cajcfn/co/cj。
蝉花与 S h a r m a ef C f/.(2018)报道的葡萄牙菌株G M S L 114和 R e h n e r e t a/.(2011)报道的韩国菌株 A R S E F 7260相距更远。这从系统发育上证明了本系 列论文第1篇（李增智等2020)里提出的 质疑，即S a m s o n(1974)组合的 PaecZ/omyces cicodae Isario (Paecilomyces) c/_cadae(Luangsa-ard ef a/. 2005)是一个物 种复合（species c o m p l e x)。
2.2形态描述
从子座上和孢梗束上分离出的无性型之 间以及与B A001菌株之间的培养特征和显微 特征一致。
蝉花新种
Cordyceps chanhua Z.Z.Li,F.G.L u a n,H y w e l-Jones,C.R.L i &S.L.Z h a n g,sp. n o v.
MycoBank MB835243
子座：从蝉若虫头部及前胸背板各长出一 个具淡橙或淡桔黄的柄，多次二歧分枝，可形成淡桔黄或橙的可孕的头1-8个以 上。也可二歧分枝同时产生子座和孢梗束。子囊壳半埋生，拟卵形，外壁单层，透明，长 476-602n m，宽 222-319^m，无间丝。子 囊无透明，圆筒形，有深裂的子囊帽，成熟 时长235-38〇n m，宽2-3n m。子囊孢子8个，光滑，丝状，无透明，长247-360[i m，宽 1.5-1.8p m，断裂成 6.4-13.8x2.l-3.1n m 长的 分孢子。
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表i用于多位点系统发育分析的菌株
Table 1 List of strains and their GenBank accession numbers of sequences used for phylogenetic analysis in this study
物种Taxon 菌株号
Strain
产地
Origin
GenBank检索号
GenBank accession number可转换债券
ITS LSU SSU TEF RPB1RPB2
Beauverio ARSEF 1478巴西HQ880764HQ880836—KJ523140KJ500427HQ880908 bassiano Brazil
Beauverio BCC 16585泰国JN049867JF415967—JN049885JF415991JF416009 brongniartii Thailand
Cordyceps EFCC 8260韩国-EF468807EF468953EF468855EF468910EF468747 bifusispora Korea
Cordyceps TBRC 7253/泰国MF140739MF140705—MF140774MF140798MF140825 blackw elliae BBH23883Thailand
Cordyceps TBRC 7258泰国AY624173———MG665236JQ425688 cateniannulatus Thailand
Cordyceps CBS中国贵州AY624173—AY526466—MG665236JQ425688 cateniobliqua153.83 T Guizhou, China
Cordyceps cf.ARSEF韩国一EF468819EF468964EF468867EF468921EF468759 ochroceostrom oto5691Korea
Cordyceps TBRC泰国KT261393MF140732———KT261403 chiongdo oensis7274 T Thailand
Cordyceps ARSEF韩国HQ880826——HQ880898HQ880970HQ881017 cicodae7260Korea
Cordyceps GMSL 114葡萄牙LT220698————LT220790 cicodae Portugal
Cordyceps YHICYY 101中国云南-KP743160KP743168KP743140KP743147KP743152 cicodae Yunnan, China
Cordyceps RCEF中国广西AF368801MF416552MF416605MF416496MF416653MF416447 cicadae HP090724Guangxi, China
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Cordyceps CBS加纳AY624177JF415988—JN049903JF416006JF416028 coleopterorum110.73 T Ghana
Cordyceps CBS丹麦AY624181FJ765253——GU979973GQ250022
fo rin o so111113T Denmark
Cordyceps CBS 244.31爱尔兰AY624182MG665230MF416609——JQ425690
fum o so ro sea Ireland
Cordyceps BS 105.73 T加纳AY624185—MN296399—一—
ghanensis Ghana
Cordyceps BCC79817泰国—MN275697MN296395MN338485MN338490MN338480 jakajanicola Thailand
安全心理学论文
待续
菌物学报99
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