(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610130836.2
(22)申请日 2016.03.09
(71)申请人 四川大学
地址 610065 四川省成都市武侯区一环路
南一段24号
(72)发明人 但卫华 崔国廉 但年华
(51)Int.Cl.
A61L 24/08(2006.01)
A61L 24/00(2006.01)
(54)发明名称氧化羧甲基纤维素钠-多巴胺生物医用胶及其制备方法(57)摘要本发明公开了一种能够与伤口产生原位交联的生物医用胶黏剂及其制备方法。所述胶黏剂按如下方法制备：首先，用高碘酸钠氧化羧甲基纤维素钠制得双醛羧甲基纤维素钠，透析、干燥后将产物溶于MES缓冲溶液中，然后将一定量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺同样溶于上述MES缓冲液中，搅拌反应10~40min，接着加入多巴胺，在氮气保护下搅拌反应8~24h后，透析、冻干、真空保存。使用前，先用双氧水或辣根过氧化物酶预处理伤口，然后将冻干的胶黏剂用PBS缓冲液溶解后立即涂覆到创面伤口处，2~10min内即可粘合伤口。该生物胶在体内湿润环境下有较强的粘合强度，生物相容性好，可生物降解，能有效地促进伤口 愈合。权利要求书1页 说明书4页CN 105770981 A 2016.07.20
C N 105770981
A
1.氧化羧甲基纤维素钠-多巴胺生物医用胶是由多巴胺接枝氧化羧甲基纤维素钠制得，其关键性能指标如下：
（1）外观：红褐或红灰，粘稠状物；
（2）重金属含量：≤10μg/g(m/m)；
（3）粘合力：猪皮搭接剪切强度不低于60kPa;
（4）细胞毒性：细胞毒性反应不大于Ⅰ级；
（5）无菌试验：无菌；
（6）致敏试验：无迟发型超敏反应；
（7）皮内反应试验：原发性刺激指数PII＜0.4。
2.权利要求1所述的氧化羧甲基纤维素钠-多巴胺生物医用胶，特征在于，其制备方法包括如下步骤：
（1）氧化羧甲基纤维素钠的制备：称取2g羧甲基纤维素钠溶解于50~200mL、pH为2.0~5.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，室温下搅拌至澄清，接着将0.5~2g的高碘酸钠避光溶解在25~100mL上述缓冲液中，并缓慢加入上述羧甲基纤维素钠溶液中，在温度为25~40℃条件下避光搅拌反应24~48h，待反应结束后加入乙二醇5~20mL，继续搅拌0.5~1h，然后加入2~5g氯化钠，并缓慢加入200~400ml的甲醇，静置、抽滤，将析出的沉淀装入截留分子量为3000~3500Da或8000~12000Da的透析袋中，用蒸馏水透析1~3天后，取截留液在压力0~20Pa、温度-100~-30℃条件下冷冻干燥48~72h，即得氧化羧甲基纤维素钠；
（2）氧化羧甲基纤维素钠-多巴胺生物医用胶的制备：称取一定质量的氧化羧甲基纤维素钠，溶于pH为4.5~6.5的MES缓冲液中，配成质量浓度为1%~5%的溶液，然后将一定质量比例的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）溶于上述氧化羧甲基纤维素钠溶液中，20~40℃下反应10~40min，再加入一定质量比例的多巴胺，20~40℃、氮气保护条件下，继续搅拌反应8~24h，制得多巴胺接枝氧化羧甲基纤维素钠，装入截留分子量为3000~3500Da或8000~12000Da的透析袋中，用蒸馏水透析1~3天后，取截留液在压力0~20Pa、温度-100~-30℃条件下冷冻干燥48~72h，即得氧化羧甲基纤维素钠-多巴胺生物医用胶黏剂，使用前将冻干的生物医用胶黏剂溶解于pH为7.0~8.0的PBS缓冲液中，并立即涂覆到经质量浓度为3%~30%的双氧水或酶活性单位为10~40U/mL的辣根过氧化物酶清洗的伤口处，2~10min内即可粘合伤口。
3.根据权利要求2所述氧化羧甲基纤维素钠-多巴胺生物医用胶及制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述的羧甲基纤维素钠的羧甲基化率为70%~90%，氧化后醛基含量为30%~60%。
4.根据权利要求2所述氧化羧甲基纤维素钠-多巴胺生物医用胶及制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述的氧化羧甲基纤维素钠与EDC和NHS的投料质量比为1.0:0.8~3.0:0.2~1.0，氧化羧甲基纤维素钠与多巴胺投料质量比为1.0:0.3~1.2，产物中多巴胺接枝率为5%~30%，溶解于PBS缓冲液制成的生物医用胶的质量浓度为2%~10%，涂覆到伤口的涂覆量为0.01~0.1mL/mm 2。
权 利 要 求 书1/1页CN 105770981 A
氧化羧甲基纤维素钠-多巴胺生物医用胶及其制备方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种具有良好生物相容性、生物降解性和强粘合力，兼具填充、密封和止血功能的医用伤口粘合剂及其制备方法，属于生物医用材料制备领域。
背景技术
[0002]近年来，随着科技的发展，医学水平逐渐提高，临床上对手术操作和辅助材料的要求也越来越高，
然而，传统上对伤口粘合主要采用缝合线、铆钉等材料或器械缝合，这种方法不仅操作麻烦，而且屡次换药拆线会增加病人的痛苦，使愈合后的创面留有疤痕甚至干扰组织功能的复原，无疑会带给患者二次伤害。因此，人们一直渴望研制出一种理想的组织粘合剂来替代缝合线。实际上，很早以前人们就已经开始使用组织粘合剂，上世纪五六十年代问世的α-氰基丙烯酸酯衍生物类粘合剂实现了外科手术由缝扎到直接粘合的大革命。这类粘合剂虽然粘合强度很大，但生物相容性差，容易引起皮肤炎症反应，因此，很快在纤维蛋白类粘合剂问世后，逐渐被取代。纤维蛋白粘合剂有很多优点，如良好的生物相容性和生物可降解性，能够密封、止血、粘合伤口，并能促进伤口愈合，目前已经在外科领域得到广泛应用，是临床上使用最多的手术粘合剂之一。但是，它也存在着粘合强度低、制备时间长、价格昂贵的缺点以及潜在的病毒感染风险，这些缺点无疑会限制纤维蛋白粘合剂的长远应用，很可能在到一种合适的组织粘合剂后而被淘汰（崔国廉，但年华，但卫华，等.基于生物质的医用粘合剂及应用现状与发展前景[J].皮革科学与工程，2015，25（5）：33-40.）。其它粘合剂如明胶-戊二醛类、丙烯酸酯类等都存在着生物相容性差、粘合强度低的缺点，因此，亟需研制出一种生物相容性好、在体内湿润环境中粘合强度高、可生物降解、价格低、使用安全、方便，同时又兼具一定的止血、密封和促进伤口愈合功能的生物医用粘合剂。[0003]羧甲基纤维素钠是天然纤维素经化学改性而得到的一种可溶的纤维素衍生物，具有良好的生物相容性，可生物降解，是一种较好的组织工程支架材料。羧甲基纤维素钠被证明具有一定的粘合性能（郑江，陈怡，高亚辉，等.三种胶体材料及其复合物作为骨粘合剂的粘合强度比较[J]. 中国海洋药物杂志，2009，28（1）：26-28.），已经有一些将羧甲基纤维素钠制成生物胶的报道，如中国
发明专利CN104645407A报道，用羧甲基纤维素钠、氯化钠和载有生长因子的壳聚糖微球制成，用于皮肤及上皮组织的修复。然而，单纯的羧甲基纤维素钠粘合性能不足，需要经过一定的改性来增加其粘合性能。近年来，人们通过对贻贝足丝超强粘附力原因进行的大量研究，发现了与贻贝粘蛋白成分结构类似的多巴胺能够赋予材料在湿润环境中强粘附力，如中国发明专利CN104056300A报道，一些天然多糖接枝多巴胺后粘合性能得到很大提高。并且，大量研究证明，多巴胺具有良好的生物相容性，能够促进细胞粘附和增殖，其邻酚羟基被氧化为醌或半醌后能与组织中的氨基或巯基发生席夫碱反应，自身也歧化反应形成自由基，发生偶联反应，最终与组织形成交联，增强与组织的粘附力和内聚力。经过氧化后的羧甲基纤维素钠含有醛基，能与皮肤组织的氨基产生交联，因此，多巴胺接枝氧化羧甲基纤维素钠制得的生物胶综合了二者的优点，粘合强度、使用安全性和价格方面必将优于目前临床上广泛使用的纤维蛋白粘合剂。
发明内容
[0004]本发明的目的是针对现有粘合剂生物相容性低、体内湿润环境下粘合强度不足而提供的一种能够与伤口产生原位交联的生物医用胶黏剂及其制备和使用方法，该医用胶黏剂生物相容性好，降解过程可控，可被机体完全降解吸收，体内湿润条件下粘合强度高，又兼具填充、密封和止血功能，同时可以促进组织愈合，可作为一种医用组织粘合剂、密封剂或止血剂用于临床创伤修复。
[0005]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
（1）氧化羧甲基纤维素钠的制备：称取2g羧甲基纤维素钠溶解于50~200mL、pH为2.0~ 5.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，室温下搅拌至澄清，接着将0.5~2g的高碘酸钠避光溶解在25~100mL上述缓冲液中，并缓慢加入上述羧甲基纤维素钠溶液中，在温度为25~40℃条件下避光搅拌反应24~48h，待反应结束后加入乙二醇5~20mL，继续搅拌0.5~1h，然后加入2~5g氯化钠，并缓慢加入200~400ml的甲醇，静置、抽滤，将析出的沉淀装入截留分子量为3000~ 3500Da或8000~12000Da的透析袋中，用蒸馏水透析1~3天后，取截留液在压力0~20Pa、温度-100~-30℃条件下冷冻干燥48~72h，即得氧化羧甲基纤维素钠；
（2）氧化羧甲基纤维素钠-多巴胺生物医用胶的制备：称取一定质量的氧化羧甲基纤维素钠，溶于pH为4.5~6.5的MES缓冲液中，配成质量浓度为1%~5%的溶液，然后将一定质量比例的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）溶于上述氧化羧甲基纤维素钠溶液中，20~40℃下反应10~40min，再加入一定质量比例的多巴胺，20~40℃、氮气保护条件下，继续搅拌反应8~24h，制得多巴胺接枝氧化羧甲基纤维素钠，装入截留分子量为3000~3500Da或8000~12000Da的透析袋中，用蒸馏水透析1~3天后，取截留液在压力0~20Pa、温度-100~-30℃条件下冷冻干燥48~72h，即得氧化羧甲基纤维素钠-多巴胺生物医用胶，使用前将冻干的生物医用胶黏剂溶解于pH为7.0~8.0的PBS缓冲液中，并立即涂覆到经质量浓度为3%~30%的双氧水或酶活性单位为10~40U/mL的辣根过氧化物酶清洗的伤口处，2~10min内即可粘合伤口。
[0006]进一步地，步骤（1）中所述的羧甲基纤维素钠的羧甲基化率为70%~90%，氧化后醛基含量为30
%~60%。
[0007]步骤（2）所述的氧化羧甲基纤维素钠与EDC和NHS的投料质量比为1.0:0.8~3.0: 0.2~1.0，氧化羧甲基纤维素钠与多巴胺投料质量比为1.0:0.3~1.2，产物中多巴胺接枝率为5%~30%。溶解于PBS缓冲液制成的生物医用胶的质量浓度为2%~10%，涂覆到伤口的涂覆量为0.01~0.1mL/mm2。
[0008]本发明所得氧化羧甲基纤维素钠-多巴胺生物医用胶满足以下关键性能指标：（1）外观：红褐或红灰，粘稠状物；
（2）重金属含量：≤10μg/g(m/m)；
（3）粘合力：猪皮搭接剪切强度不低于60kPa；
（4）细胞毒性：细胞毒性反应不大于Ⅰ级；
（5）无菌试验：无菌；
（6）致敏试验：无迟发型超敏反应；
（7）皮内反应试验：原发性刺激指数PII＜0.4。
[0009]与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：
（1）所制生物医用胶具有良好的
（2）生物相容性和体内湿润环境下强粘附力，粘合效果优于临床上广泛使用的纤维蛋白胶；
（3）可生物降解，保水性好，可使伤口保持湿润环境，能够促进细胞粘附、增殖和伤口愈合；
降解产物能被机体完全吸收；
（4）原位交联粘合快，效果好，也可作为密封剂或止血剂用于（5）制作简单，成本低，原料易得。
临床；
具体实施方式
[0010]下面通过实施对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，而不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述发明的内容作出一些非本质的改进和调整。
[0011]实施例1
（1）氧化羧甲基纤维素钠的制备：称取2g羧甲基纤维素钠溶解于50mL、pH为2.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，室温下搅拌至澄清，接着将0.5g的高碘酸钠避光溶解在25mL上述缓冲液中，并缓慢加入上述羧甲基纤维素钠溶液中，在温度为25℃条件下避光搅拌反应24h，待反应结束后加入乙二醇5mL，继续搅拌0.5h，然后加入2g氯化钠，并缓慢加入200ml的甲醇，静置、抽滤，将析出的沉淀装入截留分子量为3000~3500Da的透析袋中，用蒸馏水透析1天后，取截留液在压力5Pa、温度-100℃条件下冷冻干燥48h，即得氧化羧甲基纤维素钠；
（2）氧化羧甲基纤维素钠-多巴胺生物医用胶的制备：称取一定质量的氧化羧甲基纤维素钠，溶于pH为4.5的MES缓冲液中，配成质量浓度为1%的溶液，然后按照氧化羧甲基纤维素钠与EDC和NHS的投料质量比为1.0:0.8:0.4的比例加入EDC和NHS，20℃下反应10min，再按照氧化羧甲基纤维素钠与多巴胺投料质量比为1.0:0.3的比例加入多巴胺，20℃、氮气保护条件下，继续搅拌反应8h，制得多巴胺接枝氧化羧甲基纤维素钠，装入截留分子量为3000~ 3500Da的透析袋中，用蒸馏水透析1天后，取截留液在压力5Pa、温度-100℃条件下冷冻干燥48h，即得氧化羧甲基纤维素钠-多巴胺生物医用胶，使用前将冻干的生物医用胶黏剂溶解于pH为7.0的PBS缓冲液中，配成质量浓度为2%的生物医用胶黏剂，并立即涂覆到经质量浓度为3%的双氧水或酶活性单位为10U/mL的辣根过氧化物酶清洗的伤口处，10min内即可粘合伤口。
[0012]实施例2
（1）氧化羧甲基纤维素钠的制备：称取2g羧甲基纤维素钠溶解于100mL、pH为3.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，室温下搅拌至澄清，接着将1g的高碘酸钠避光溶解在50mL上述缓冲液中，并缓慢加入上述羧甲基纤维素钠溶液中，在温度为35℃条件下避光搅拌反应36h，待反应结束后加入乙二醇10mL，继续搅拌0.5h，然后加入3g氯化钠，并缓慢加入300ml的甲醇，静置、抽滤，将析出的沉淀装入截留分子量为8000~12000Da的透析袋中，用蒸馏水透析2天后，取截留液在压力15Pa、温度-60℃条件下冷冻干燥60h，即得双醛羧甲基纤维素钠；
（2）氧化羧甲基纤维素钠-多巴胺生物医用胶的制备：称取一定质量的氧化羧甲基纤维素钠，溶于pH为5.5的MES缓冲液中，配成质量浓度为3%的溶液，然后按照氧化羧甲基纤维素钠与EDC和NHS的投料质量比为1.0:2.0:0.8的比例加入EDC和NHS溶于上述氧化羧甲基纤维素钠溶液中，35℃下反应30min，再按照氧化羧甲基纤维素钠与多巴胺投料质量比为1.0: 1.0的比例加入多巴胺，35℃、氮气保护条件下，继续搅拌反应15h，制得多巴胺接枝氧化羧
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