(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910955974.8
(22)申请日 2019.10.09
(71)申请人 上海昂博生物技术有限公司
地址 200000 上海市奉贤区化学工业区奉
贤分区楚工路388号综合楼3-4层
(72)发明人 徐大平 张国庆 白俊才 周游
(74)专利代理机构 北京劲创知识产权代理事务
所(普通合伙) 11589
代理人 张铁兰
(51)Int.Cl.
C07K 7/23(2006.01)
C07K 1/06(2006.01)
C07K 1/04(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明涉及多肽药物化学合成领域，尤其为
一种醋酸加尼瑞克的制备方法，包括如下步骤：
S1，将Fmoc -Rinker连接到氨基树脂载体上，依照 Fmoc固相多肽合成原理，用适当比例的Fmoc -
Rinker/HOBt/DIC合成替代率为0.3～1.0mmoL/g
的Fmoc -Rinker amide氨基树脂；S2，Fmoc -Rink
amide氨基树脂按照Fmoc固相合成法，保护氨基 酸投料前用5％HOBt/DMF洗涤树脂2遍，逐一延伸
偶联的方式得到加尼瑞克全保护十肽树脂；S3，
全保护十肽树脂N末端进行乙酰化反应，使用冰
醋酸/HOBt/DIC在冰浴0-5℃下活化5～10min与
树脂反应，然后裂解、滤液沉降在6～12倍冰冻
MTBE或乙醚中过滤或离心收集得到加尼瑞克粗
品，纯化、冻干得到醋酸加尼瑞克纯品。本发明中
反应条件温和，操作简便，成本较低，环境污染
小，便于规模化生产，有广泛的应用前景和较好
的经济社会价值。权利要求书1页 说明书5页 附图4页CN 110563812 A 2019.12.13
C N 110563812
A
1.一种醋酸加尼瑞克的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1，将Fmoc -Rinker连接到氨基树脂载体上，依照Fmoc固相多肽合成原理，用适当比例的Fmoc -Rinker/HOBt/DIC合成替代率为0.3～1.0mmoL/g的Fmoc -Rinker amide氨基树脂；
S2，Fmoc -Rink amide氨基树脂按照Fmoc固相合成法，保护氨基酸投料前用5％HOBt/DMF洗涤树脂2遍，逐一延伸偶联的方式得到加尼瑞克全保护十肽树脂；
S3，全保护十肽树脂N末端进行乙酰化反应，使用冰醋酸/HOBt/DIC在冰浴0-5℃下活化5～10min与树脂反应，避免肽测链活性基团乙酰化的副反应，然后裂解、滤液沉降在6～12倍冰冻MTBE或乙醚中过滤或离心收集得到加尼瑞克粗品，纯化、冻干得到醋酸加尼瑞克纯品。
2.根据权利要求1所述的一种醋酸加尼瑞克的制备方法，其特征在于，所述S1，氨基树脂载体优先选择AM树脂制得的Fmoc -Rinker amide氨基树脂替代度范围为0.30mmo/g～1.00mmol/g ，优先选择0.50mmol/g～0.90mmol/g。
3.根据权利要求1所述的一种醋酸加尼瑞克的制备方法，其特征在于，所述S1，Fmoc -Rinker通过HOBt/DIC作用连接到氨基树脂载体上，且制得Fmoc -Rinker amide氨基树脂替代度为0.30mmol/g～1.00mmol/g，其中所述氨基树脂为MBHA树脂、AM树脂、BHA树脂或Sieber树脂。
4.根据权利要求1所述的一种醋酸加尼瑞克的制备方法，其特征在于，所述S2，保护氨基酸如下：Fmoc -D -Ala -OH ,Fmoc -Pro -OH ,Fmoc -L -HomoArg(Et)2-OH.HCl ,Fmoc -Leu -OH ,Fmoc -D -HomoArg(Et)2-OH.HCl ,Fmoc -Tyr(tBu)-OH ,Fmoc -Ser(tBu)-OH ,Fmoc -3-(3-Pyridyl)-D -Ala -OH ,Fmoc -D -Phe(4-Cl)-OH ,Fmoc -3-(2-naphthyl)-D -Ala -OH，氨基酸投料摩尔比为1.5～6倍，优先选择1.5～2.5倍。
5.根据权利要求1所述的一种醋酸加尼瑞克的制备方法，其特征在于，所述S2，偶联时可使用如下缩合剂组合中的任意一种：DIC/Y ,EDC.HCl/Y ,HBTU/Y/Z ,HATU/Y/Z ,HCTU/Y/Z ,TBTU/Y/Z ,PyBOP/Y/Z ,PyAOP/Y/Z，其中Y＝HOBt或HOAt或Cl -HOBt ,Z＝DIPEA或NMM或TMP，优先选择DIC/HOBt或DIC/Cl -HOBt。
6.根据权利要求1所述的一种醋酸加尼瑞克的制备方法，其特征在于，所述S3，裂解剂为三氟乙酸与水的混合物，三氟乙酸、三异丙基硅烷与水的混合物三氟乙酸与、水、EDT、三异丙基硅烷的混合物或三氟乙酸、水、DODT、三异丙基硅烷的混合物，在裂解侧链保护基时优先选择三氟乙酸与、水、EDT、三异丙基硅烷的混合物，比例92.5％:2.5％:2.5％:2.5％在25℃左右裂解2h。
7.根据权利要求1所述的一种醋酸加尼瑞克的制备方法，其特征在于，所述S3，沉降在6～12倍冰冻MTBE或乙醚用量为滤液体积的6～12倍，优先选择8～10倍。
权 利 要 求 书1/1页CN 110563812 A
一种醋酸加尼瑞克的制备方法
技术领域
[0001]本发明属于多肽药物化学合成领域，涉及一种醋酸加尼瑞克的制备方法。
背景技术
[0002]醋酸加尼瑞克Ganirelix acetate肽序为：
[0003]Ac-D-2-NaI-D-Phe(4-Cl)-2-D-Pal-Ser-Tyr-D-HomoArg(Et)2-Leu-HomoArg (Et)2-Pro-D-Ala-NH2 acetate，分子式：C80H113ClN18O13，分子量为1570.34，其结构式如下：
[0004]
[0005]醋酸加尼瑞克是一种促性腺激素释放激素GnRH的拮抗剂，是一种对天然GnRH的第1、2、3、6、8和10位氨基酸进行置换的人工合成十肽化合物，临床上主要在妇女接受辅助生殖技术控制性卵巢刺激方案中使用，预防过早出现促黄体激素峰，用于因该原因引起的生育障碍，该多肽为默沙东公司研发、生产，1999年在美国上市，2013年经中国国家食品药品监督管理总局批准在中国上市，商品名为
[0006]目前国内关于醋酸加尼瑞克合成的情况大致如下：如专利CN104017058B中报道，肽序列中6和8
位氨基酸使用Fmoc-D-Lys(Dde)-OH和Fmoc-Lys(Dde)-OH，逐步偶联得到加尼瑞克粗品，该方法主要存在如下缺点：氨基酸脱除Dde保护再修饰，需要用到剧毒试剂水合肼，不利于工厂化大规模安全操作生产，对环境危害大，脱完侧链保护再修饰，操作繁琐且容易产生工艺上不可控的副反应杂质，在专利CN107056894A中，使用5+5片段法合成，涉及保护基多，操作繁琐，效率低下，且片段法Tyr容易产生消旋杂质，纯化分离难度大，不利于规模化生产。
[0007]国外专利如US5767082采用的Boc固相合成法，每一步脱保护都需要用到TFA，操作繁琐，且废液收集难处理，多肽从树脂上裂解需要用到HF，对设备要求高，对环境污染大，不利于大规模工业化生产，因此需要一种醋酸加尼瑞克的制备方法对上述问题做出改善。
发明内容
[0008]本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种醋酸加尼瑞克的制备方法。
[0009]为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
[0010]一种醋酸加尼瑞克的制备方法，包括如下步骤：S1，将Fmoc-Rinker连接到氨基树脂载体上，依照Fmoc固相多肽合成原理，用适当比例的Fmoc-Rinker/HOBt/DIC合成替代率为0.3～1.0mmoL/g的Fmoc-Rinker amide氨基树脂；
[0011]S2，Fmoc-Rink amide氨基树脂按照Fmoc固相合成法，保护氨基酸投料前用5％HOBt/DMF洗涤树脂2遍，逐一延伸偶联的方式得到加尼瑞克全保护十肽树脂；
[0012]S3，全保护十肽树脂N末端进行乙酰化反应，使用冰醋酸/HOBt/DIC在冰浴0-5℃下活化5～10min与树脂反应，避免肽测链活性基团乙酰化的副反应，然后裂解、滤液沉降在6～12倍冰冻MTBE或乙醚中过滤或离心收集得到加尼瑞克粗品，纯化、冻干得到醋酸加尼瑞克纯品。
[0013]优选的，所述S1，氨基树脂载体优先选择AM树脂制得的Fmoc-Rinker amide氨基树脂替代度范围为0.30mmo/g～1.00mmol/g，优先选择0.50mmol/g～0.90mmol/g。
[0014]优选的，所述S1，Fmoc-Rinker通过HOBt/DIC作用连接到氨基树脂载体上，且制得Fmoc-Rinker amide氨基树脂替代度为0.30mmol/g～1.00mmol/g，其中所述氨基树脂为MBHA树脂、AM树脂、BHA树脂或Sieber树脂。
[0015]优选的，所述S2，保护氨基酸如下：Fmoc-D-Ala-OH,Fmoc-Pro-OH,Fmoc-L-HomoArg (Et)2-OH.HCl,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-D-HomoArg(Et)2-OH.HCl,Fmoc-Tyr(tBu)-OH,Fmoc-Ser (tBu)-OH,Fmoc-3-(3-Pyridyl)-D-Ala-OH,Fmoc-D-Phe(4-Cl)-OH,Fmoc-3-(2-naphthyl)-D-Ala-OH，氨基酸投料摩尔比为1.5～6倍，优先选择1.5～2.5倍。
[0016]优选的，所述S2，偶联时可使用如下缩合剂组合中的任意一种：DIC/Y,EDC.HCl/Y, HBTU/Y/Z,HATU/Y/Z,HCTU/Y/Z,TBTU/Y/Z,PyBOP/Y/Z,PyAOP/Y/Z，其中Y＝HOBt或HOAt或Cl-HOBt,Z＝DIPEA或NMM或TMP，优先选择DIC/HOBt或DIC/Cl-HOBt。
[0017]优选的，所述S3，裂解剂为三氟乙酸与水的混合物，三氟乙酸、三异丙基硅烷与水的混合物三氟乙酸与、水、EDT、三异丙基硅烷的混合物或三氟乙酸、水、DODT、三异丙基硅烷的混合物，在裂解侧链保护基时优先选择三氟乙酸与、水、EDT、三异丙基硅烷的混合物，比例92.5％:2.5％:2.5％:2.5％在25℃左右裂解2h。
[0018]优选的，所述S3，沉降在6～12倍冰冻MTBE或乙醚用量为滤液体积的6～12倍，优先选择8～10倍。
[0019]与现有技术相比，本发明提出了一种醋酸加尼瑞克的制备方法，具有以下有益效果：
[0020]1、本发明提出了一种醋酸加尼瑞克的制备方法，该反应条件温和，生产周期短，成本较低，有广泛的应用前景和较好的经济社会价值。
[0021]2、本发明使用固相多肽合成技术，到了一种避免序列乙酰化副反应的方法，操作工艺简单，粗品纯度和收率高，杂质含量低，环境污染小，便于提高下游纯化收率和产品最终纯度，具有大规模生产的应用价值。
附图说明
[0022]图1为本发明一种醋酸加尼瑞克的制备方法的加尼瑞克粗品HPLC图：保留时间RT ＝7.896min，纯度84.52％；
[0023]图2为本发明一种醋酸加尼瑞克的制备方法的加尼瑞克粗品ESI-MS图：[M+H]+＝
1569.67,[M+2H]2+＝785.59；
[0024]图3为本发明一种醋酸加尼瑞克的制备方法的缩写或英文全称示例图。
具体实施方式
[0025]下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0026]请参照图1-3，一种醋酸加尼瑞克的制备方法，S1，将Fmoc-Rinker连接到氨基树脂载体上，依照Fmoc固相多肽合成原理，用适当比例的Fmoc-Rinker/HOBt/DIC合成替代率为0.3～1.0mmoL/g的Fmoc-Rinker amide氨基树脂；
[0027]S2，Fmoc-Rink amide氨基树脂按照Fmoc固相合成法，保护氨基酸投料前用5％HOBt/DMF洗涤树脂2遍，逐一延伸偶联的方式得到加尼瑞克全保护十肽树脂；
[0028]S3，全保护十肽树脂N末端进行乙酰化反应，使用冰醋酸/HOBt/DIC在冰浴0-5℃下活化5～10min与树脂反应，避免肽测链活性基团乙酰化的副反应，然后裂解、滤液沉降在6～12倍冰冻MTBE或乙醚中过滤或离心收集得到加尼瑞克粗品，纯化、冻干得到醋酸加尼瑞克纯品。
[0029]所述S1，氨基树脂载体优先选择AM树脂制得的Fmoc-Rinker amide氨基树脂替代度范围为0.30mmo/g～1.00mmol/g，优先选择0.50mmol/g～0.90mmol/g。
[0030]所述S1，Fmoc-Rinker通过HOBt/DIC作用连接到氨基树脂载体上，且制得Fmoc-Rinker amide氨基树脂替代度为0.30mmol/g～1.00mmol/g，其中所述氨基树脂为MBHA树脂、AM树脂、BHA树脂或Sieber树脂。
[0031]所述S2，保护氨基酸如下：Fmoc-D-Ala-OH,Fmoc-Pro-OH,Fmoc-L-HomoArg(Et)2-OH.HCl,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-D-HomoArg(Et)2-OH.HCl,Fmoc-Tyr(tBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-3-(3-Pyridyl)-D-Ala-OH,Fmoc-D-Phe(4-Cl)-OH,Fmoc-3-(2-naphthyl)-D-Ala-OH，氨基酸投料摩尔比为1.5～6倍，优先选择1.5～2.5倍。
[0032]所述S2，偶联时可使用如下缩合剂组合中的任意一种：DIC/Y,EDC.HCl/Y,HBTU/Y/ Z,HATU/Y/Z,HCTU/Y/Z,TBTU/Y/Z,PyBOP/Y/Z,PyAOP/Y/Z，其中Y＝HOBt或HOAt或Cl-HOBt,Z ＝DIPEA或NMM或TMP，优先选择DIC/HOBt或DIC/Cl-HOBt。
[0033]所述S3，裂解剂为三氟乙酸与水的混合物，三氟乙酸、三异丙基硅烷与水的混合物三氟乙酸与、水、EDT、三异丙基硅烷的混合物或三氟乙酸、水、DODT、三异丙基硅烷的混合物，在裂解侧链保护基时优先选择三氟乙酸与、水、EDT、三异丙基硅烷的混合物，比例92.5％:2.5％:2.5％:2.5％在25℃左右裂解2h。
[0034]所述S3，沉降在6～12倍冰冻MTBE或乙醚用量为滤液体积的6～12倍，优先选择8～10倍。
[0035]具体实施方式：
[0036]实施例1
[0037] 1.Fmoc-Rinker amide AM Resin的合成
[0038]称取10gAM Resin(1.0mmol/g)于固相多肽合成反应器中，加入DMF溶涨30min，抽
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