(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710348018.4
(22)申请日 2017.05.17
(71)申请人 华侨大学
地址 362000 福建省泉州市丰泽区城东
(72)发明人 张光亚 吴姝羽 谢晨 葛慧华
(74)专利代理机构 厦门市首创君合专利事务所
有限公司 35204
代理人 张松亭 姜谧
(51)Int.Cl.
C12M 1/40(2006.01)
C12M 1/12(2006.01)
C12N 11/12(2006.01)
(54)发明名称
器及其应用
(57)摘要
本发明公开了一种基于类弹性蛋白多肽的
固定化酶反应器及其应用，包括截留孔径为0.6
中的类弹性蛋白多肽标记的融合蛋白酶，该类弹
性蛋白多肽于在NaCl存在的条件下经40～42℃
处理而充分相变，而融合蛋白酶的酶活性保持不
变。本发明的固定化酶反应结构简单、成本低廉，
实现了固定化酶的重复利用，并具有良好的工业
化应用前景。权利要求书1页 说明书5页 附图4页CN 107083329 A 2017.08.22
C N 107083329
A
1.一种基于类弹性蛋白多肽的固定化酶反应器，其特征在于：包括截留孔径为0.6～1μm的深层过滤装置和固定在深层过滤装置中的类弹性蛋白多肽标记的融合蛋白酶，该类弹性蛋白多肽于在NaCl存在的条件下经40～42℃处理而充分相变，而融合蛋白酶的酶活性保持不变，其制备方法包括：
(1)在纯化后的类弹性蛋白多肽标记的融合蛋白酶中加入2～3M NaCl，于40～42℃水浴20～25min使上述类弹性蛋白多肽充分相变； (2)将步骤(1)所得的物料送入深层过滤装置中，具体的：该深层过滤装置具有一进样口、一出样口和一排气口，在关闭出样口并打开排气口的同时，从进样口送入步骤骤(1)所得的物料，待深层过滤装置内的空气完全排出后，关闭排气口并打开出样口，以收集滤液，而充分相变的类弹性蛋白多肽标记的融合蛋白酶则固定在深层过滤装置中，形成所述固定化酶反应器。
2.如权利要求1所述的固定化酶反应器，其特征在于：所述深层过滤装置的过滤介质为纤维素材质，有效过滤面积为20～25m 2，滤膜厚度为0.4～0.6cm，最大操作压力在≤40℃时为
3.4Bar。
3.如权利要求1所述的固定化酶反应器，其特征在于：所述类弹性蛋白多肽于在NaCl存在的条件下经42℃处理20min而充分相变。
4.权利要求1至3中任一权利要求所述的固定化酶反应器的使用方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)对底物溶液置于40～42℃水浴20～25min，得到预处理后的底物溶液；
(2)将预处理后的底物溶液送入所述固定化酶反应器中进行反应，并收集产物；
(3)待步骤(2)的反应完成后，用40～42℃的蒸馏水彻底清洗所述固定化酶反应器，以除去残留的底物及产物。
权 利 要 求 书1/1页CN 107083329 A
一种基于类弹性蛋白多肽的固定化酶反应器及其应用
技术领域
[0001]本发明属于固定化酶技术领域，具体涉及一种基于类弹性蛋白多肽的固定化酶反应器及其应用。
背景技术
[0002]类弹性蛋白多肽是具有可逆相变特性的人造类弹性蛋白，其在高于相变温度时会发生相变聚体，低于相变温度时重新溶解到溶液中，申请人利用该特性开发了用于非谱分离的类弹性蛋白多肽纯化标签及纯化重组蛋白的方法。制备的标签蛋白与目标蛋白融合表达，通过一定的条件控制，利用ITC(Inverse Transition Cycle)技术实现了重组蛋白的分离纯化，并且得到了很好的分离纯化效果。但是该技术使用离心实现目标蛋白与杂质的分离，受条件限制，处理量相对较小，无法应用到生产中。因此，利用该纯化标签的优势开发一项容易实现重组蛋白分离纯化的方法对于生产应用具有关键作用。
发明内容
[0003]本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种基于类弹性蛋白多肽的固定化酶反应器。
[0004]本发明的另一目的在于提供上述基于类弹性蛋白多肽的固定化酶反应器的使用方法。
[0005]本发明的技术方案如下：
[0006]一种基于类弹性蛋白多肽的固定化酶反应器，包括截留孔径为0.6～1μm的深层过滤装置和固定在深层过滤装置中的类弹性蛋白多肽标记的融合蛋白酶，该类弹性蛋白多肽于在NaCl存在的条件下经40～42℃处理而充分相变，而融合蛋白酶的酶活性保持不变，其制备方法包括：
[0007](1)在纯化后的类弹性蛋白多肽标记的融合蛋白酶中加入2～3M NaCl，于40～42℃水浴20～25min使上述类弹性蛋白多肽充分相变；
[0008](2)将步骤(1)所得的物料送入深层过滤装置中，具体的：该深层过滤装置具有一进样口、一出样口和一排气口，在关闭出样口并打开排气口的同时，从进样口送入步骤骤(1)所得的物料，待深层过滤装置内的空气完全排出后，关闭排气口并打开出样口，以收集滤液，而充分相变的类弹性蛋白多肽标记的融合蛋白酶则固定在深层过滤装置中，形成所述固定化酶反应器。
[0009]在本发明的一个优选实施方案中，所述深层过滤装置的过滤介质为纤维素材质，有效过滤面积为20～25m2，滤膜厚度为0.4～0.6cm，最大操作压力在≤40℃时为3.4Bar。[0010]在本发明的一个优选实
施方案中，所述类弹性蛋白多肽于在NaCl存在的条件下经42℃处理20min而充分相变。
[0011]上述固定化酶反应器的使用方法，包括如下步骤：
[0012](1)对底物溶液置于40～42℃水浴20～25min，得到预处理后的底物溶液；
[0013](2)将预处理后的底物溶液送入所述固定化酶反应器中进行反应，并收集产物；[0014](3)待步骤(2)的反应完成后，用40～42℃的蒸馏水彻底清洗所述固定化酶反应器，以除去残留的底物及产物。
[0015]本发明的有益效果：本发明的固定化酶反应结构简单、成本低廉，实现了固定化酶的重复利用，并具有良好的工业化应用前景。
附图说明
[0016]图1为本发明实施例1的类弹性蛋白多肽40的ITC及深层过滤纯化电泳图，其中，M 泳道：marker；泳道1：类弹性蛋白多肽40粗酶；泳道2：ITC一轮纯化上清；泳道3：ITC二轮纯化上清；泳道4：深层过滤一次洗脱液；泳道5：深层过滤二次洗脱液。
[0017]图2为本发明实施例1的类弹性蛋白多肽40的ITC循环纯化与深层过滤纯化结果对比图，其中，一上：ITC循环第一次纯化的上清液；一洗：深层过滤第一次洗脱液；二上：ITC循环第二次纯化的上清液；二洗：深层过滤第二次洗脱液。
[0018]图3为本发明实施例2的E-C的ITC及深层过滤纯化电泳图，其中，M泳道：marker；泳道1：E-C粗酶；泳道2：ITC一轮纯化上清；泳道3：深层过滤洗脱液。
[0019]图4为本发明实施例2的E-C的ITC循环纯化与深层过滤纯化结果对比图，其中，一上：ITC循环第一次纯化的上清液；洗脱液：深层过滤第一次洗脱液。
[0020]图5为本发明实施例3的X-E的ITC及深层过滤纯化电泳图，其中，M泳道：marker；泳道1：X-E粗酶；泳道2：ITC一轮纯化上清；泳道3：ITC二轮纯化上清；泳道4：深层过滤一次洗脱液；泳道5：深层过滤二次洗脱液。
[0021]图6为本发明实施例4的膜固定化B-E的反应产物生成量图。
[0022]图7为本发明实施例4的膜固定化X-E的反应产物生成量。
具体实施方式
[0023]以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。[0024]实施例1
[0025]类弹性蛋白多肽40是40个重复单位类弹性蛋白多肽的标签蛋白，其理论分子量为18kDa。利用深层过滤偶联类弹性蛋白多肽相变进行类弹性蛋白多肽40的分离纯化。类弹性蛋白多肽具有相变会聚集形
成沉淀物的特性，对其进行深层过滤处理，将目标蛋白截留在深层过滤滤膜上，洗去其余杂质，从而实现蛋白的分离及纯化。
[0026]具体实施过程：首先，对类弹性蛋白多肽40菌株进行培养，具体操作如下：1)将甘油菌按1∶100的体积比接入到含氨苄青霉素(Amp)(100mg/L)的LB液体中培养(OD600值为0.6-1.0，时间为10-12h)；2)将以上得到的菌体母液按1∶100的接种量接种于TB培养基中，置于37℃摇床，以200r/min的速度培养3-4h；3)加入IPTG(终浓度为1mM)诱导培养7h；4)在4000r/min速度下将菌液离心20min，按照菌液与PBS缓冲液20∶1的比例加入PBS缓冲液重悬菌体，重复洗涤菌体2-3次；5)用超声波破碎机进行细胞破碎，设定条件为超2s，停2s，80个循环，然后在4℃，8000r/min条件下离心10min收集细胞破碎上清液。
[0027]然后将收集到的类弹性蛋白多肽40粗蛋白液(破碎后上清液)分别进行深层过滤纯化及ITC纯化，对比两个纯化方法的效率及得率。具体操作如下：
[0028]深层过滤分离：
[0029](1)蒸馏水40℃保温10min，润洗乳胶管和滤器；
[0030](2)用40℃保温的3M NaCl盐缓冲液润洗乳胶管和滤器；
[0031](3)在类弹性蛋白多肽40粗蛋白液中加入3M NaCl，于40℃水浴20min使上述类弹性蛋白多肽40充
分相变；
[0032](4)用深层过滤装置对上一步骤所得的物料进行过滤，具体的：该深层过滤装置具有一进样口、一出样口和一排气口，在关闭出样口并打开排气口的同时，从进样口送入上一步骤所得的物料，待深层过滤装置内的空气完全排出后，关闭排气口并打开出样口，以收集含有杂质的滤液，而充分相变的类弹性蛋白多肽40蛋白则留在深层过滤装置中；
[0033](3)从进样口送入适量冰浴预冷的PBS缓冲液，使留在深层过滤装置内的充分相变的类弹性蛋白多肽40重新溶解，并洗脱下来；
[0034](4)将步骤(3)所洗脱下来的物料重新加入3M NaCl，于40℃水浴20min使其中类弹性蛋白多肽40再次充分相变，并重复步骤(2)和(3)，即得纯化后的类弹性蛋白多肽40；[0035]ITC纯化：
[0036](1)类弹性蛋白多肽40粗蛋白液中加入3M NaCl，40℃保温20min使目标蛋白相变；[0037](2)10000r/min下常温离心10min，弃上清，收集沉淀；
[0038](3)沉淀重悬于预冷的PBS缓冲液中，冰浴3h；
[0039](4)10000r/min下4℃离心10min，弃沉淀，收集上清液。
[0040](5)重复上述1-4步骤进行ITC二次纯化，得纯化后的类弹性蛋白多肽40。[0041]上述PBS(1000mL)配方为18.98g十二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)，22.94g二水合磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)，调节pH至6.4。
[0042]上述深层过滤器来自Merck/Millipore公司的Millistak+POD CE50。该滤器中过滤介质为纤维素材质，有效过滤面积为23m2，滤膜厚度为0.5cm：，最大操作压力为3.4Bar (≤40℃)，截留孔径在0.6-1μm范围内。
[0043]对上述两个纯化方法效果进行比较，从电泳图(图1)中可看出，第一次纯化及第二次纯化两种方法的效果相当，能得到基本一致的蛋白纯度。以ITC纯化作为比较，可从图2中看出，同一次纯化过程中，深层过滤方法纯化得到的蛋白含量均在ITC纯化方法之上，由此可见，深层过滤方法在类弹性蛋白多肽标签纯化策略中的应用前景是可观的。
[0044]实施例2
[0045]E-C是类弹性蛋白多肽40串联SpyCatcher蛋白结构域的一个重组蛋白，其理论分子量为35kDa。E-C蛋白的表达及两种方法的分离纯化同实施例1中的类弹性蛋白多肽40。从图3中看出，我们可以将目标蛋白截留在深层过滤的滤膜上，并且经过一次过滤可以的到相对较高浓度的蛋白。通过对滤液和洗脱液中的蛋白含量进行检测也可分析得到深层过滤方法成功的截留了目标蛋白，且回收的蛋白含量与ITC
纯化相当。(图4)
[0046]过滤之于离心最主要的优势是，过滤方法比离心技术更具有工业应用前景，过滤比较容易放大生产，处理量比离心技术大得多，而且相比较来说过滤方法缩短了时间成本，在大规模生产应用中更具有实用价值。
[0047]实施例3
[0048]X-E是木聚糖酶(Xylanase)串联类弹性蛋白多肽40得到的重组蛋白，其理论分子
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