[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公开说明书
[11]公开号CN 1276729A [43]公开日2000年12月13日
[21]申请号98809911.X [21]申请号98809911.X [22]申请日98.8.6[30]优先权
[32]1997.08.07 [33]US [31]08/908,526
[86]国际申请PCT/US98/16423 1998.08.06
[87]国际公布WO99/07407 EN 1999.02.18
[85]进入国家阶段日期2000.04.06
[71]申请人儿童医院研究基金会
地址美国俄亥俄州
[72]发明人D·A·布里格斯托克 P·A·哈丁
[74]专利代理机构中国专利代理(香港)有限公司
代理人卢新华 谭明胜[51]Int.CI 7A61K 38/18C07K 14/475C07H 21/04
C12N 15/63
权利要求书 3 页 说明书 26 页 附图 4 页 [54]发明名称
肝素结合生长因子(HBGF)多肽
[57]摘要
本发明提供基本上纯的肝素结合生长因子多肽
(HBGFs)、编码该HBGFs的核酸和与本发明的HBGFs
结合的抗体。所述的HBGF多肽用于诱导骨、软骨和
组织形成，子宫内膜的生长和发育，以及加速伤口愈
98809911.X权 利 要 求 书第1/3页
1.一种基本上纯的多肽，其特征在于：
a)具有对应于结缔组织生长因子(C T G F)蛋白的羧基末端氨基酸的氨基酸序列；
b)与肝素结合并且被大约0.8M盐从肝素中洗脱出来；以及
c)通过还原S D S-P A G E技术，具有大约10-k D a的分子量。
2.权利要求1的多肽，其中该多肽具有从CTGF的N-末端的氨基酸残基247位开始的氨基酸序列。
3.权利要求1的多肽，其中该多肽具有从CTGF的N-末端的氨基酸残基248位开始的氨基酸序列。
4.一种分离的编码具有权利要求1、2或3的任一种氨基酸序列多肽的多核苷酸序列。
5.一种含有权利要求4的多核苷酸的重组表达载体。
7.权利要求6的宿主细胞，它是原核生物细胞。
8.权利要求6的宿主细胞，它是真核生物细胞。
9.一种抗体，它与权利要求1的多肽结合和与其免疫反应片段结合。
10.权利要求9的抗体，其中所述的抗体为多克隆抗体。
11.权利要求9的抗体，其中所述的抗体为单克隆抗体。
12.一种动脉粥样硬化或纤维变性、硬化或细胞增殖失调的方法，该方法包括把细胞与有效量的如下多肽的拮抗剂接触，所述的多肽特征在于： a)具有来源于结缔组织生长因子(CTGF)蛋白的羧基末端氨基酸的氨基酸序列；
b)与肝素结合并被大约0.8M盐从肝素中洗脱出来；以及
c)通过还原S D S-P A G E技术，具有大约为10-k D a的分子量。
13.一种在需要这种的患者中加速伤口愈合的方法，该方法包括把细胞与有效量的含有如下多肽的组合物接触，所述的多肽具有的特征为：
a)具有来源于结缔组织生长因子(CTGF)蛋白的羧基末端氨基酸的氨基酸序列；
b)与肝素结合并且被0.8M盐从肝素中洗脱出来；以及
c)通过还原S D S-P A G E技术，具有大约为10-k D a的分子量。
14.权利要求12或13的方法，其中所述的细胞选自表皮细胞、肌肉细胞、结缔组织细胞和内皮细胞。
15.权利要求14的方法，其中所述的结缔组织细胞选自星形胶质细胞、成纤维细胞、破骨细胞、成骨细胞和软骨细胞。
16.权利要求14的方法，其中所述的肌肉细胞是平滑肌细胞。
17.权利要求14的方法，其中所述的肌肉细胞是心肌细胞。
18.权利要求14的方法，其中所述的内皮细胞是毛细血管内皮细胞。
19.权利要求14的方法，其中所述的表皮细胞是分泌性表皮细胞。
20.权利要求12或13的方法，该方法进一步包括把细胞与选自如下组中的生长因子接触：这些生长因子包括：胰岛素样生长因子(IGF-I)、血小板衍生的生长因子(P D G F)、表皮生长因子(E G F)、转化生长因子β(T G F-β)和碱性成纤维细胞生长因子(b F G F)。
21.权利要求20的方法，该方法进一步包括把细胞与肝素接触。
22.权利要求21的方法，其中肝素的浓度范围大约1μg/m l～100μg/ml。
23.一种鉴定影响权利要求1多肽的活性的化合物的方法，该方法包括：
a)在足以使所述的组分相互作用的条件下，把该化合物与权利要求1的多肽或其生物活性片段或表达权利要求1多肽的重组细胞温育；并
b)测定该化合物对权利要求1多肽的活性或表达的影响。
24.权利要求23的方法，其中所指的影响是抑制权利要求1多肽的活性或表达。
25.权利要求23的方法，其中所指的影响是刺激权利要求1多肽的活性或表达。
26.一种诊断被疑患有特征在于与HBGF有关的疾病的患者HBGF 病情的方法，该方法包括从该患者中获
得疑有含HBGF的样品；测定在该样品中的HBGF水平并且把样品中的HBGF水平与正常标准样品中的HBGF水平相比较。
27.权利要求26的方法，其中所述的疾病选自动脉粥样硬化、纤维变性、硬化或细胞增殖失调。
28.一种和HBGF有关的病情的方法，该方法包括给患有所述病情的患者施用有效量的包含在药用可接受的载体中的HBGF反应剂。
29.权利要求28的方法，其中所述的疾病是以细胞过度生长为特征的细胞增殖失调。
30.权利要求29的方法，其中所述的细胞过度生长是由于结缔组织细胞过度生长。
31.权利要求28的方法，其中H B G F反应剂是H B G F拮抗剂。
32.权利要求31的方法，其中所述的拮抗剂是特异地与HBGF多肽结合的抗体。
33.权利要求28的方法，其中所述的疾病是以缺乏细胞生长为特征的细胞增殖失调。
34.一种药物组合物，包括承载于药学上可接受的载体中的有效量的HBGF。
35.一种调节子宫内膜或胎盘膜生长的方法。
98809911.X说 明 书第1/26页
肝素结合生长因子(HBGF)多肽
1.发明领域
本发明总得说来涉及生长因子领域，更具体地说涉及肝素结合生长因子(HBGF)。
2.发明背景
生长因子是一类在发育的组织中刺激靶细胞增殖、分化和形成结构的多肽。生长因子的作用依赖于它们与激发细胞内信号传导事件的特异受体的结合。生长因子的实例包括来源于血小板的生长因子(PDGF)、
胰岛素样生长因子(IGF-I、IGF-II)、转化生长因子β(TGF-β)、
转化生长因子α(TGF-α)、表皮生长因子(EGF)、酸性和碱性成
纤维细胞生长因子(aFGF、bFGF)和结缔组织生长因子(CTGF)，
这些都是熟知的刺激细胞增殖的生长因子。
PDGF是一种在循环血小板的α颗粒中发现的阳离子热稳定的蛋
白，已知它是诸如成纤维细胞和平滑肌细胞等结缔组织细胞的促有丝分裂剂和趋化剂。由于该分子的这些活性，认为PDGF是一种涉及伤口正
常愈合和病理学上对如动脉粥样硬化和纤维变性病等病情起作用的主要因子。PDGF是由α和/或β链结合组成的二聚体分子。这些链形成异二
聚体或同二聚体，并且迄今为止所分离到的所有结合体均具有生物学活性。
对组织再生和修复中各种生长因子的作用的研究导致发现PDGF样
蛋白。这些蛋白具有和PDGF一样的免疫学和生物学活性并能被特异抗
P D G F的抗体所封闭。正逐步认识到多肽生长因子和细胞因子是子宫蛋白的重要一类，这些子宫蛋白可能形成母体子宫和发育的胚胎或胎儿之间的生长信号传导通路。对各种物种中的研究表明，E G F、结合肝素的E G F 样生长因子(HB-EGF)、IGF-I、IGF-II、aFGF、bFGF、多
效因子(pleitrophin(PTN))、白血病抑制因子、集落刺激因子-1(CSF
-1)和TGF-α可能是涉及这些过程的子宫生长调节分子的成员。
CTGF是富含半胱氨酸分子量38,000的单体肽，它是一种对结缔组
织细胞具促有丝分裂和趋化活性的生长因子。CTGF由细胞所分泌，与
特异的细胞表面受体相互作用而表现活性。CTGF是与PDGF的α或β链
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