(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711137487.8
(22)申请日 2017.11.16
(71)申请人 中国农业科学院麻类研究所
地址 410205 湖南省长沙市咸嘉湖西路348
号
(72)发明人 程超华 粟建光 唐蜻 戴志刚
许英 杨泽茂 高红 刘婵
方冬兵 文海兵 邓灿辉
(74)专利代理机构 长沙星耀专利事务所(普通
合伙) 43205
代理人 张慧 赵静华
(51)Int.Cl.
C12N 15/84(2006.01)
A01H 4/00(2006.01)
A01H 5/00(2018.01)
A01H 6/28(2018.01)
(54)发明名称一种农杆菌介导的转基因方法(57)摘要一种农杆菌介导的转基因方法，包括以下步骤：（1）将种子经无菌处理、播种得到3日龄种子无菌苗；（2）在超净工作台上，将子叶从3日龄种子无菌苗上撕下，切去叶尖，正置于芽诱导培养基；（3）将含有外源基因的根癌农杆菌复活，浸染子叶外植体并进行共培养；（4）用无菌水冲洗子叶5-10遍，将子叶用滤纸吸干，转入筛选培养基中培养，得小苗；（5）将所得小苗转入含有筛选剂的生根培养基中培养，得转基因苗；（6）转 入水培液或基质中进行驯化。本发明首次建立了转基因体系，通过转基因方法将目的外源基因导入到中，为品种改良和基
因功能研究等打下了基础。权利要求书1页 说明书4页 附图2页CN 107630034 A 2018.01.26
C N 107630034
A
1.一种农杆菌介导的转基因方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将种子经无菌处理、播种，得到3日龄种子无菌苗；
（2）在超净工作台上，将子叶从3日龄种子无菌苗上撕下，切去叶尖，正置于含噻苯隆和α-萘乙酸的芽诱导培养基上，所述芽诱导培养基为MS培养基，噻苯隆浓度为0.1-2mg/L，α-萘乙酸浓度为0.01-0.2mg/L , 附加蔗糖30g/L，琼脂6-7g/L，pH5.5-6.0，光照强度2200-2600lx，光照时间16-18h/d，温度24±2℃，培养时间为0-4天；
（3）将含有外源基因的根癌农杆菌复活，7000-9000rpm离心8-12分钟，用液体MS培养基将离心沉淀悬浮至OD600为0.8-1.0，加入乙酰丁香酮, 至悬浮液中乙酰丁香酮的含量为90-110mmol/L，所述液体M
S培养基含噻苯隆浓度为0.1-2mg/L，α-萘乙酸浓度为0.01-0.2mg/L；用悬浮液浸染步骤（2）所得子叶20-240分钟后于洁净滤纸上吸干菌液；再将子叶转入共培养基中培养1-4天，所述共培养基成份为：MS培养基，含噻苯隆0.1-2mg/L，α-萘乙酸0.01-0.2mg/L ，乙酰丁香酮90-110mmol/L；
（4）用含有300-600mg/L头孢霉素和300-600mg/L羧苄青霉素的无菌水冲洗子叶，将子叶用滤纸吸干，转入筛选培养基中，培养22-28天，得小苗；
所述筛选培养基的成份为：MS培养基，含噻苯隆0.1-2mg/L，α-萘乙酸0.01-0.2mg/L ，头孢霉素300-600mg/L，羧苄青霉素300-600mg/L，筛选剂；
（5）将步骤（4）所得小苗转入含有筛选剂的生根培养基中，所述生根培养基成份为：MS 培养基，含吲哚乙酸0.01-0.2mg/L，筛选剂；培养30-60天，得转基因苗；
（6）将步骤（5）所得转基因苗转入水培液或基质中进行驯化。
2.根据权利要求1所述的农杆菌介导的转基因方法，其特征在于，步骤（2）中，撕下的子叶为靠下胚轴部分。
3.根据权利要求1或2所述的农杆菌介导的转基因方法，其特征在于，步骤（2）和步骤（3）中，所述筛选剂为潮霉素或除草剂，若筛选剂为潮霉素，则浓度为30-40mg/L，用筛选剂为除草剂，则浓度为2-
5mg/L。
4.根据权利要求1或2所述的农杆菌介导的转基因方法，其特征在于，步骤（6）中，所述水培液为不含有机成分的液体MS培养基，稀释1-4倍。
5.根据权利要求1或2所述的农杆菌介导的转基因方法，其特征在于，步骤（6）中，所述基质为泥炭：蛭石：珍珠岩以体积比2.8-3.2:1:1混合。
6.根据权利要求1或2所述的农杆菌介导的转基因方法，其特征在于，步骤（3）中，含有外源基因的根癌农杆菌，通过以下方法得到：将含有GUS基因的载体pcambia1304导入GV3101根癌农杆菌；或将含有GUS基因的载体ptf102导入EH101根癌农杆菌。
权 利 要 求 书1/1页CN 107630034 A
一种农杆菌介导的转基因方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种农杆菌介导的转基因方法。
背景技术
[0002]（Cannabis Sativa L.）是一种环境适应性优良、吸附重金属能力强的天然纤维植物，在纺织、制药、建材、能源等领域发挥着不容低估的作用，具有广阔的发展前景。纤用在中国种植历史悠久，种植面积居世界前列。药用则是近年来发展迅速的产业领域，二酚（CBD）安全无致幻成瘾作用，具有抗痉挛、抗风湿性关节炎、抗焦虑等药理活性，对多种癌症有效果，是制药行业的重要原料，在国际市场供不应求。因此，对优异品种的需求也十分迫切。但因是常异花授粉作物，遗传背景复杂，传统的育种方法改良品种进展缓慢。
[0003]转基因方法是研究基因功能、改良品种的有效途径。高效转基因体系建立的前提是高效再生体系的建立，但是，是一种再生和遗传转化顽拗型植物，其再生效率较低，限制了转基因体系的建立，迄今为止，并无成功的转基因体系建立的报道。
发明内容
[0004]本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种可以更快的获得改良品种的农杆菌介导的转基因方法。
[0005]本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种农杆菌介导的转基因方法，包括以下步骤：
（1）将种子经无菌处理、播种得到3日龄种子无菌苗；
具体操作方法可参见以下文献：程超华，李育君，赵立宁，唐蜻，臧巩固，三重处理法获得种子无菌苗研究[J]. 中国麻业科学. 2011, 33(1):24-26；
（2）在超净工作台上，将子叶从3日龄种子无菌苗上撕下（不宜切下，否则会影响再生频率），切去叶尖，正置于含噻苯隆（TDZ）和α-萘乙酸（NAA）的芽诱导培养基上，所述芽诱导培养基为MS培养基，噻苯隆浓度为0.1-2mg/L，α-萘乙酸浓度为0.01-0.2mg/L, 附加蔗糖30g/ L，琼脂（6-7）g/L，pH5.5-6.0，光照强度2200-2600lx，光照时间16-18h/d，温度24±2℃，培养时间为0-4天；
进一步，撕下的子叶为靠下胚轴部分；
（3）将含有外源基因的根癌农杆菌复活，7000-9000rpm离心8-12分钟，用液体MS培养基将离心沉淀悬浮至OD600为0.8-1.0，加入乙酰丁香酮（AS）, 至悬浮液中乙酰丁香酮的含量为90-110mmol/L，所述液体MS培养基含噻苯隆浓度为0.1-2mg/L，α-萘乙酸浓度为0.01-0.2mg/L；用悬浮液浸染步骤（2）所得子叶20-240分钟后于洁净滤纸上吸干菌液；再将子叶转入共培养基中培养1-4天，所述共培养基成份为：MS培养基，含噻苯隆0.1-2mg/L，α-萘乙酸0.01-0.2mg/L ，乙酰丁香酮90-110mmol/L；
含有外源基因的根癌农杆菌，可以通过以下方法得到：将含有G U S基因的载体
pcambia1304导入GV3101根癌农杆菌；或将含有GUS基因的载体ptf102导入EH101根癌农杆菌。原料、载体、菌种都可通过市售途径获得。
[0006]（4）用含有300-600mg/L头孢霉素和300-600mg/L羧苄青霉素的无菌水冲洗子叶(优选5-10遍)，将子叶用滤纸吸干，转入筛选培养基中，培养22-28天，得小苗；
所述筛选培养基的成份为：MS培养基，含噻苯隆0.1-2mg/L，α-萘乙酸0.01-0.2mg/L ，头孢霉素300-600mg/L，羧苄青霉素300-600mg/L，筛选剂；所述筛选剂优选为潮霉素或除草剂，若筛选剂为潮霉素，则浓度为30-40mg/L，用筛选剂为除草剂，则浓度为2-5mg/L；
（5）将步骤（4）所得小苗转入含有筛选剂的生根培养基中，所述生根培养基成份为：MS 培养基，含吲哚乙酸（IAA）0.01-0.2mg/L，筛选剂；所述筛选剂优选为潮霉素或除草剂，若筛选剂为潮霉素，则浓度为30-40mg/L，用筛选剂为除草剂，则浓度为2-5mg/L；培养30-60天，得转基因苗；
（6）将步骤（5）所得转基因苗转入水培液或基质中进行驯化。之后可移栽。所述水培液为不含有机成分的液体MS培养基，稀释1-4倍。所述基质为泥炭：蛭石：珍珠岩以体积比2.8-3.2:1:1混合。
[0007]本发明以无菌苗子叶为外植体，结合组织培养、生长调节剂，首次建立了转基因体系，通过转基因方法将有用的外源基因导入到中，为品种改良和基因功能研究等打下了良好基础。
附图说明
[0008]图1为实施例1外源GUS基因在子叶外植体中表达图；
图2为实施例1外源GUS基因在愈伤组织中中表达图；
图3为实施例1外源GUS基因在根中表达图；
图4为实施例1外源GUS基因在叶片中表达图。
具体实施方式
[0009]以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
[0010]实施例1
本实施例包括以下步骤：
（1）将种子经无菌处理、播种得到3日龄种子无菌苗；
具体操作方法参见程超华，李育君，赵立宁，唐蜻，臧巩固，三重处理法获得种子无菌苗研究[J]. 中国麻业科学. 2011, 33(1):24-26；
（2）在超净工作台上，将子叶从3日龄种子无菌苗上撕下，切去叶尖，正置于含噻苯隆（TDZ）和α-萘乙酸（NAA）的芽诱导培养基上，所述芽诱导培养基为MS培养基，噻苯隆浓度为0.1mg/L，α-萘乙酸浓
度为0.01mg/L, 附加蔗糖30g/L，琼脂6g/L，pH5.5-6.0，光照强度2200lx，光照时间16/d，温度24±2℃，培养时间为1天；
撕下的子叶为靠下胚轴部分；
（3）将含有外源基因的GV3101根癌农杆菌（含有外源基因的GV3101根癌农杆菌通过以下方法得到：将含有GUS基因的载体pcambia1304导入GV3101根癌农杆菌；本实施例使用的含有GUS基因的载体pcambia1304和GV3101根癌农杆菌均购自武汉菌种保藏中心）复活，
7000rpm离心8分钟，用液体MS培养基将离心沉淀悬浮至OD600为0.8，加入乙酰丁香酮（AS）, 至悬浮液中乙酰丁香酮的含量为90mmol/L，所述液体MS培养基含噻苯隆浓度为0.1mg/L，α-萘乙酸浓度为0.01mg/L；用悬浮液浸染步骤（2）所得子叶30分钟后于洁净滤纸上吸干菌液；再将子叶转入共培养基中培养1天，所述共培养基成份为：MS培养基，含噻苯隆0.1mg/L，α-萘乙酸0.01mg/L ，乙酰丁香酮90mmol/L；
（4）用含有300mg/L头孢霉素和300mg/L羧苄青霉素的无菌水冲洗子叶5遍，将子叶用滤纸吸干，转入筛选培养基中，培养22天，得小苗；
所述筛选培养基的成份为：MS培养基，含噻苯隆0.1mg/L，α-萘乙酸0.01mg/L ，头孢霉素300mg/L，羧苄青霉素300mg/L，筛选剂；所述筛选剂为潮霉素，浓度为30mg/L；
（5）将步骤（4）所得小苗转入含有筛选剂的生根培养基中，所述生根培养基成份为：MS 培养基，含吲哚乙酸（IAA）0.01mg/L，筛选剂；所述筛选剂为潮霉素，浓度为30-40mg/L；培养50天，得转基因苗；
（6）将步骤（5）所得转基因苗转入水培液中进行驯化。之后可移栽。所述水培液为不含有机成分的液体MS培养基。
[0011]在步骤（4）-（6）的实施过程中，对外植体、愈伤组织、小苗各部位进行GUS染检测，从而判断外源基因是否转入并表达（如图1-4所示）。
[0012]图中颜较深的部分为外源基因的表达。由图1-4可知，外源基因在外植体、愈伤组织、小苗根和叶片中均有表达。
[0013]实施例2
本实施例包括以下步骤：
（1）将种子经无菌处理、播种得到3日龄种子无菌苗；
具体操作方法参见程超华，李育君，赵立宁，唐蜻，臧巩固，三重处理法获得种子无菌苗研究[J]. 中国麻业科学. 2011, 33(1):24-26；
（2）在超净工作台上，将子叶从3日龄种子无菌苗上撕下，切去叶尖，正置于含噻苯隆（TDZ）和α-萘乙酸（NAA）的芽诱导培养基上，所述芽诱导培养基为MS培养基，噻苯隆浓度为2mg/L，α-萘乙酸浓度为0.2mg/L, 附加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.5-6.0，光照强度2600lx，光照时间18h/d，温度24±2℃，培养时间为4天；
撕下的子叶为靠下胚轴部分。
[0014]（3）将含有外源基因的EH101根癌农杆菌（含有外源基因的EH101根癌农杆菌通过以下方法得到：将含有GUS基因的载体ptf102导入EH101根癌农杆菌；含有GUS基因的载体ptf102和EH101根癌农杆菌均购自武汉菌种保藏中心）复活， 9000rpm离心12分钟，用液体MS培养基将离心沉淀悬浮至OD600为1.0，加入乙酰丁香酮（AS）, 至悬浮液中乙酰丁香酮的含量为110mmol/L，所述液体MS培养基含噻苯隆浓度为2mg/L，α-萘乙酸浓度为0.2mg/L；用悬浮液浸染步骤（2）所得子叶30分钟后于洁净滤纸上吸干菌液；再将子叶转入共培养基中培养4天，所述共培养基成份为：MS培养基，含噻苯隆2mg/L，α-萘乙酸0.2mg/L ，乙酰丁香酮110mmol/L；
（4）用含有600mg/L头孢霉素和600mg/L羧苄青霉素的无菌水冲洗子叶6遍，将子叶用滤纸吸干，转入筛选培养基中，培养28天，得小苗；
所述筛选培养基的成份为：MS培养基，含噻苯隆2mg/L，α-萘乙酸0.2mg/L，头孢霉素
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