(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810755315.5
(22)申请日 2018.07.11
(71)申请人 袁新华
地址 211198 江苏省南京市江宁区龙眠大
道639号中国药科大学
(72)发明人 袁新华 徐嘉辰
(51)Int.Cl.
A61K 31/11(2006.01)
A61K 31/366(2006.01)
A61K 31/343(2006.01)
A61K 31/365(2006.01)
A61P 9/00(2006.01)
(54)发明名称
一种Grp94抑制剂
(57)摘要
本发明公开了一种Grp94抑制剂。本发明发
现，α-山道年、β-山道年对Grp94蛋白的抑制作 用最强，其次为6-甲氧基半棉酚、2-O -甲基异半
棉酸内酯，最后为3β,4β-环氧沉香呋喃、8β-
白抑制作用强，而且选择性强，对Hsp90α抑制作
用极弱。3,4-二羟基二氢沉香呋喃虽然与3β,4
β-环氧沉香呋喃结构接近，但是对Grp94、Hsp90
α抑制作用均极弱。由此可见，6-甲氧基半棉酚、
2-O -甲基异半棉酸内酯、3β,4β-环氧沉香呋
喃、8β-乙氧基苍术内酯Ⅱ、α-山道年、β-山道
年为有效的Grp94选择性抑制剂。权利要求书1页 说明书5页 附图3页CN 109010326 A 2018.12.18
C N 109010326
A
1.α-山道年或β-山道年用作Grp94抑制剂的用途。
2.α-山道年或β-山道年用于制备心肌肥大的药物的用途。 3.一种心肌肥大的药物，含有Grp94抑制剂，该抑制剂为α-山道年或β-山道年。
4.根据权利要求3所述的药物，其特征在于，还含有药学上可以接受的辅料。
权 利 要 求 书1/1页CN 109010326 A
一种Grp94抑制剂
技术领域
[0001]本发明属于生物医药领域，具体涉及萜类化合物用作Grp94抑制剂的用途。
背景技术
[0002]热休克蛋白Hsp90是细胞内高度保守的一类蛋白，其主要功能是辅助细胞内其他蛋白(客户蛋白)的 成熟。Hsp90包括四个亚型，分别是细胞质中的Hsp90α/β，线粒体中的TRAP1和内质网中的Grp94。作为Hsp90的内质网亚型，Grp94的客户蛋白广泛参与炎症相关性疾病的发生发展中，如心肌炎、心肌肥大、结肠炎等。
[0003]Grp94抑制剂在心肌炎、心肌肥大、结肠炎等炎症相关疾病的方面具有巨大价值。
发明内容
[0004]本发明的目的在于提供萜类化合物用作Grp94抑制剂的用途。
[0005]本发明技术方案如下：
[0006]6-甲氧基半棉酚用作Grp94抑制剂的用途。
[0007]6-甲氧基半棉酚用于制备心肌肥大的药物的用途。
[0008]一种心肌肥大的药物，含有Grp94抑制剂，该抑制剂为6-甲氧基半棉酚。[0009]进一步地，还含有药学上可以接受的辅料。
[0010]2-O-甲基异半棉酸内酯用作Grp94抑制剂的用途。
[0011]2-O-甲基异半棉酸内酯用于制备心肌肥大的药物的用途。
[0012]一种心肌肥大的药物，含有Grp94抑制剂，该抑制剂为2-O-甲基异半棉酸内酯。
[0013]进一步地，还含有药学上可以接受的辅料。
[0014]3β,4β-环氧沉香呋喃用作Grp94抑制剂的用途。
[0015]3β,4β-环氧沉香呋喃用于制备心肌肥大的药物的用途。
[0016]一种心肌肥大的药物，含有Grp94抑制剂，该抑制剂为3β,4β-环氧沉香呋喃。[0017]进一步地，还含有药学上可以接受的辅料。
[0018]8β-乙氧基苍术内酯Ⅱ用作Grp94抑制剂的用途。
[0019]8β-乙氧基苍术内酯Ⅱ用于制备心肌肥大的药物的用途。
[0020]一种心肌肥大的药物，含有Grp94抑制剂，该抑制剂为8β-乙氧基苍术内酯Ⅱ。[0021]进一步地，还含有药学上可以接受的辅料。
[0022]α-山道年或β-山道年用作Grp94抑制剂的用途。
[0023]α-山道年或β-山道年用于制备心肌肥大的药物的用途。
[0024]一种心肌肥大的药物，含有Grp94抑制剂，该抑制剂为α-山道年或β-山道年。[0025]进一步地，还含有药学上可以接受的辅料。
[0026]有益效果：
[0027]本发明发现，6-甲氧基半棉酚、2-O-甲基异半棉酸内酯、3β,4β-环氧沉香呋喃、8β-乙氧基苍术内酯Ⅱ、α-山道年、β-山道年为有效的Grp94选择性抑制剂。
附图说明
[0028]图1为实施例测试的化合物的化学结构；
[0029]图2为各化合物对心肌肥大细胞中Grp94基因表达的影响；
[0030]图3为各化合物对心肌肥大细胞氧化应激的影响。
具体实施方式
[0031]下面结合附图和实施例介绍本发明实质性内容，但本发明的保护范围并不局限于此。
[0032]实施例1：分子水平抑制试验
[0033]一、实验材料
[0034]6-甲氧基半棉酚(CAS登录号：50399-95-6)、2-O-甲基异半棉酸内酯(CAS登录号：61470-49-3)、3β,4β-环氧沉香呋喃(CAS登录号：149117-37-3)、3,4-二羟基二氢沉香呋喃(CAS登录号：141554-22-5)、8β-乙氧基苍术内酯Ⅱ(CAS登录号：113269-35-5)、α-山道年(CAS登录号：481-06-1)、β-山道年(CAS登录号：481-07-2)购买或自制，纯度不低于98％。各化合物的结构式如图1所示。
[0035]二、实验方法
[0036]化合物对G r p94、H s p90α抑制活性采用荧光偏正的方法测试(参见文献CN108147978A)。
[0037]通过测试化合物与荧光基团标记的格尔德霉素(GM-FITC)竞争性结合重组Grp94、Hsp90α蛋白的能力，反应化合物对Grp94、Hsp90α的抑制作用。
[0038]测试中使用384孔黑板(型号为Corning#3575)，测试终体积选择60μL，所测试化合物和GM-FITC溶解于DMSO中备用。将化合物用assay buffer倍比稀释12个浓度梯度后每个孔板加入20μL稀释好的化合物，每个孔板再加入20μL用assay buffer稀释好的6nM/L(终浓度)的GM-FITC，再加入20μL用assay buffer稀释好的15nM/L(终浓度)蛋白。每个化合物浓度设定两个附孔，每次实验设置空白对照(20μL GM-
FITC+40μL assay buffer)和阴性对照(20μL GM-FITC+20μL蛋白+20μL assay buffer)。之后在4℃摇床上震摇孵育2h，用Synergy 读板器扫板，激发波长设置为485nm，发射波长设置为535nm，结果Graphpad Prism 6分析。根据不同浓度抑制率计算IC50值。
[0039]三、实验结果
[0040]各化合物对Grp94、Hsp90α蛋白的IC50值如表1所示。
[0041]表1各化合物对Grp94蛋白的IC50值
[0042]
[0043]上述化合物中，α-山道年、β-山道年对Grp94蛋白的抑制作用最强，其次为6-甲氧基半棉酚、2-O-甲基异半棉酸内酯，最后为3β,4β-环氧沉香呋喃、8β-乙氧基苍术内酯Ⅱ。这6个化合物不但对Grp94蛋白抑制作用强，而且选择性强，对Hsp90α抑制作用极弱。3,4-二羟基二氢沉香呋喃虽然与3β,4β-环氧沉香呋喃结构接近，但是对Grp94、Hsp90α抑制作用均极弱。
[0044]实施例2：细胞水平抑制试验
[0045]一、实验材料
[0046]6-甲氧基半棉酚(CAS登录号：50399-95-6)、2-O-甲基异半棉酸内酯(CAS登录号：61470-49-3)、3β,4β-环氧沉香呋喃(CAS登录号：149117-37-3)、3,4-二羟基二氢沉香呋喃(CAS登录号：141554-22-5)、8β-乙氧基苍术内酯Ⅱ(CAS登录号：113269-35-5)、α-山道年(CAS登录号：481-06-1)、β-山道年(CAS登录号：481-07-2)购买或自制，纯度不低于98％。各化合物的结构式如图1所示。
[0047]1～2日龄Wistar乳鼠由南京江宁青龙山动物中心提供。DMEM、胎牛血清购自赛默飞世尔生物化学制品有限公司。Trizol、RT-PCR试剂盒购自Invitrogen公司；SYBR Green PCRMaster Mix试剂盒购自美国Applied Biosystems公司。RT-PCR引物由上海生工设计合成。SOD、MDA检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
[0048]二、实验方法
[0049]1、心肌肥大细胞模型的构建及分组给药
[0050]取Wistar乳鼠，75％乙醇皮肤消毒后剪除头部，开胸取心脏，放置装有DMEM的无菌玻璃平皿中洗净血污，每个心脏剪成大小均匀的组织块，将所有组织块转移至无菌离心管中，加0.25％胰酶在37℃恒温水浴中振摇消化、自然沉降。收集细胞悬液于离心试管中，加入等体积预冷细胞培养液(DMEM+10％FBS)混匀，经200目无菌不锈钢网滤过后装置另一离心管中，2500r/min离心2min，弃上清液，沉淀加入培养液吹打均匀制成细胞悬液，接种于细胞瓶中，按差速贴壁分离法预接种。2h后将未贴壁细胞吸出，在培养液中加入5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BRDU，0.1mmol/L)，48h后将培养液换为无血清的培养液，饥饿12h。心肌细胞随机分为：对照组只加入培养液，异丙肾上腺素10μM(模型)组、各化合物5μM与异丙肾上腺素10μM 共同给药组，各组细胞给予相应物质后于培养箱中孵育48h，备用。
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