(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010074354.6
(22)申请日 2020.04.01
(71)申请人 广东南芯医疗科技有限公司
地址 510000 广东省广州市黄埔区瑞和路
83号A栋A501
(72)发明人 张召 刁嘉茵 雷春燕 肖妮
陈涛
(74)专利代理机构 广州嘉权专利商标事务所有
限公司 44205
代理人 许飞
(51)Int.Cl.
G01N 30/02(2006.01)
G01N 30/06(2006.01)
G01N 30/72(2006.01)
G01N 30/88(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种同时检测血液样品中多
种水溶性维生素的方法，首先通过简单的提取方
法对生物样本进行前处理，然后进入谱分离及
质谱检测，针对每种维生素分别选择一对定性离
子和一对定量离子，以各种维生素的相对保留时
准曲线定量。同时，本方法应用三个水平的质控
品考察方法的准确性、有效性，避免检测结果失
真。本发明首次实现了应用LC -MS技术对一份血
清样本中的十三种水溶性维生素同时检测的目
的，减小了干扰物影响，该方法操作简便快速分
析时间仅10min，高通量、成本低，有效监测人体内水溶性维生素水平，对维生素的合理、安全补充具有指导意义，
易于临床推广及普及。权利要求书2页 说明书7页 附图5页CN 111175406 A 2020.05.19
C N 111175406
A
1.一种血液水溶性维生素的检测方法，其特征在于，采用液质联用方法进行检测，包括以下步骤：
供试品溶液制备：取血液样品加入到甲醇、乙腈溶液中，混匀离心，取上清后再加入水：甲醇，得供试品溶液；
标准品溶液的制备：将各标准品用甲酸和甲醇/水溶液溶解配制成标准品母液，将各标准品母液液用乙腈/甲醇进行稀释至同一容量瓶中，得到系列不同浓度的混合标准品溶液；
内标溶液制备：将各内标用甲酸和甲醇/水溶液溶解配制成标准品母液，将各标准品母液液用乙腈/甲醇进行稀释至同一容量瓶中，得到系列不同浓度的混内标溶液；
二.测定
将上述制备的供试品溶液、标准品和内标溶液进行LC-MS测定。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述血液样品为血液中血浆或血清样品。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，其中洗脱采用梯度方式洗脱，流动相A 为10mM乙酸铵和0.01％甲酸混合的水溶液，流动相B为0.01％甲酸和10mM乙酸铵混合的乙腈溶液。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述供试品溶液制备的操作为：取样品200～300μL，加入甲醇：乙腈溶液800～900μL，混匀，离心，取上清氮气吹干后加入甲醇溶液得供试品溶液。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，标准品溶液制备的操作为：用甲酸和甲醇/水溶液配制各标准品的标准储备液，将各标准储备液用乙腈/甲醇进行稀释至同一容量瓶中，得到系列不同浓度的标准品溶液。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：梯度洗脱程序为：0-1.5min 98％B，1.5-2.5min 98％-85％B，2.5-6min 85％-50％B，6-
7.5min 50％-25％B，7.5-7.51min 25％-98％B，7.51-10min 98％B。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，MS检测的条件为：
电喷雾离子源ESI源；采用正离子扫描模式；雾化气流量：3L/min；加热气流量:10L/ min；
接口温度：300℃；加热块温度：400℃；DL温度：250℃；干燥气流量：10L/min。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，MS检测过程中组分测量参数如下所示：
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：谱柱为WATERS ACQUITY UPLC谱柱：2.1mm×100mm，1.7μm；柱温为35～40℃；优选的，柱温为35℃。
一种同时检测血液样品中多种水溶性维生素的方法及其应用
技术领域
[0001]本发明属于维生素分析检测领域，涉及一种同时检测血液样品中多种水溶性维生素的方法及其应用。
背景技术
[0002]维生素，分为脂溶性和水溶性维生素两类，是维持人体生命活动必须的一类有机物质，也是保持人体健康的重要活性物质。维生素缺乏或过量均会导致营养性疾病的发生，维生素B1，维生素B2，维生素B3-烟酸，维生素B3-烟酰胺，维生素B5，维生素B6-吡哆胺，维生素B6-吡哆醛，维生素B6-吡哆醇，维生素B7，维生素B9，维生素B12，维生素B13和维生素C均属于水溶性维生素，人体十三种水溶维生素缺乏或过量时会表现出不同的症状：维生素B1缺乏会导致脚气病；厌食、腹胀、消化不良、便秘；心脏功能失调等；维生素B2缺乏会导致舌炎、口角炎；脂溢性皮炎；妊娠妇女缺铁性贫血等；维生素B3缺乏可产生糙皮病，表现为皮炎、舌炎、口咽、腹泻及烦躁、失眠感觉异常等症状等；维生素B5缺乏会导 致痛风或风湿性关节炎；低血糖等；维生素B6缺乏会导致慢性炎症；神经兴奋性增强、烦躁不安、睡眠不安、全身性抽搐等；维生素B7缺乏会导致皮炎、湿疹、生长迟缓；维生素B9缺乏会导致巨幼红细胞性贫血；高同型半胱氨酸血症；流产、早产、胎儿神经血管畸形、先天愚形。维生素B12缺乏会产生巨红细胞性贫血(恶性贫血)，脊髓变形，神经和周围神经退化等；牙龈出血以及恶心、食欲不振、体重减轻等症状；维生素B13具有改善肝功能，促进肝细胞的修复作用和其它新功能。可痛风病，改进脑血管循环，增加吞噬细胞活性，提高组织再生能力，有助于治愈伤口。还可用于免疫辅药；维生素C缺乏会坏血症；口疮和口腔溃疡、牙龈出血、牙齿松动、皮肤素沉着等症状。
[0003]现有技术中，常用的维生素检测方法主要包括毛细管电泳法、电化学分析法、高效液相谱法、高效液相谱质谱联用法等。其中电泳法、电化学法、高效液相谱法存在一定的缺点，如：结果差异大、线性差、衍生化操作复杂、通量小等。而液相谱质谱具有高灵敏度、高精确度、高通量的特点，因此，研究出一种基于液相谱质谱联用的方法测定体内维生素并将其应用于临床愈发显得重要。
发明内容
[0004]本发明目的在于提供一种检测血液样品中多种水溶性维生素的液质联用分析方法。
[0005]本发明所采取的技术方案是：
[0006]本发明第一方面，提供了一种血液水溶性维生素的检测方法，采用液质联用方法进行检测，包括以下步骤：
[0007]一.溶液的制备
[0008]供试品溶液制备：取样品加入到甲醇、乙腈溶液中，混匀离心，取上清后再加入水：甲醇，得供试品溶液；
[0009]标准品溶液的制备：将各标准品用甲酸和甲醇/水溶液溶解配制成标准品母液，将各标准品母液液用乙腈/甲醇进行稀释至同一容量瓶中，得到系列不同浓度的混合标准品溶液；
[0010]内标溶液制备：将各内标用甲酸和甲醇/水溶液溶解配制成标准品母液，将各标准品母液液用乙腈/甲醇进行稀释至同一容量瓶中，得到系列不同浓度的混内标溶液；[0011]二.测定
[0012]将上述制备的供试品溶液、标准品和内标溶液进行LC-MS测定。通过本发明使用超高效液相谱-质谱法检测血清中十三种水溶性维生素，特异性强，灵敏性高，通量高，结果客观易于分析，尤其适合临床普及应用。
[0013]根据本发明的实施例，所述样品为血浆或血清样品。
[0014]根据本发明的实施例，其中洗脱采用梯度方式洗脱，流动相A为10mM乙酸铵和0.01％甲酸混合的水溶液，流动相B为0.01％甲酸和10mM乙酸铵混合的乙腈溶液。[0015]根据本发明的实施例，所述供试品溶液制备的操作为：取血清样品200～300μL，加入甲醇：乙腈溶液800～900μL，混匀，离心，取上清氮气吹干后加入甲醇溶液得供试品溶液。[0016]根据本发明的实施例，标准品溶液制备的操作为：用甲酸和甲醇/水溶液配制各标准品的标准储备液，将各标准储备液用乙腈/甲醇进行稀释至同一容量瓶中，得到系列不同浓度的标准品溶液。
[0017]根据本发明的实施例，梯度洗脱程序为：0-1.5min 98％B，1.5-2.5min 98％-85％B，2.5-6min 85％-50％B，6-7.5min 50％-25％B，7.5-7.51min 25％-98％B，7.51-10min 98％B。
[0018]根据本发明的实施例，MS检测的条件为：
[0019]电喷雾离子源ESI源；采用正离子扫描模式；雾化气流量：3L/min；加热气流量: 10L/min；接口温度：300℃；加热块温度：400℃；DL温度：250℃；干燥气流量：10L/min。[0020]根据本发明的实施例，MS检测过程中化合物测量参数如下表所示，
[0021]
[0022]
[0023]。[0024]根据本发明的实施例，谱柱为WATERS ACQUITY UPLC谱柱：2.1mm×100mm，1.7μm；柱温为35～40℃；优选的，柱温为35℃。
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