(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010588071.3
(22)申请日 2020.06.24
(71)申请人 南京济生物科技有限公司
地址 211112 江苏省南京市江宁区龙眠大
道568号南京生命科技创新园9号楼5
层
(72)发明人 苏月焱 芮勉文 谭颖茹 万瑶瑶
罗琦 田超 赵卿
(51)Int.Cl.
G01N 30/02(2006.01)
G01N 30/06(2006.01)
G01N 30/34(2006.01)
(54)发明名称
法
(57)摘要
本发明涉及基因类药物分析技术领域，
特别涉及一种质粒超螺旋DNA含量的高分离度检
时分离及评价超螺旋DNA均一化情况的分析方
Tris ‑HCl ‑NaCl的混合液为流动相，采用梯度洗
脱方法；将配制好的分析溶液上机测定。本发明
分析方法能够有效且准确的分离测定质粒DNA的
4种拓扑结构，同时可以评价其中超螺旋DNA均一
化情况，进一步评估超螺旋DNA的稳定性，从而保
证产品该指标质量检测准确。权利要求书1页 说明书6页 附图2页CN 111721871 A 2020.09.29
C N 111721871
A
1.不同拓扑结构的质粒DNA的IEX -HPLC高分离度检测方法，包括下列步骤：
a)配制分析溶液
用Tris -HCl溶液稀释样品，制成分析溶液；
b)谱条件
谱柱为阴离子交换谱柱；
A相：Tris -HCl溶液，B相：Tris -HCl&NaCl溶液，以A相和B相的混合液为流动相，流动相pH范围8.95～9.05；采用NaCl梯度洗脱方法，流速为0.5-1.2ml/min；柱温为30-40℃，检测波长为260nm；
c)上机测定
取步骤a)制成的分析溶液注入高效液相谱仪，进行谱分析，并记录谱图。
2.如权利要求1所述的IEX -HPLC检测方法，其特征在于：所述的质粒结构为：质粒的超螺旋DNA、开环DNA、线性DNA、多联体DNA。
3.如权利要求1所述的IEX -HPLC检测方法，其特征在于：所述超螺旋DNA结构形成的峰的不对称因子范围为1-1.91。
4.如权利要求1所述的IEX -HPLC检测方法，其特征在于：所述阴离子谱柱的规格为：柱长介于50mm -200mm之间，谱柱内径介于1mm -10mm之间，粒径介于1-5μm之间。
5.如权利要求4所述的IEX -HPLC检测方法，其特征在于：所述阴离子谱柱为聚甲基丙烯酸酯谱柱，柱长75mm，谱柱内径为4.6mm，粒径为2.5μm。
6.如权利要求1所述的IEX -HPLC检测方法，其特征在于：所述A相Tris -HCl溶液的浓度为0.01-0.05mol/L，B相Tris -HCl&NaCl溶液中Tris -HCl的浓度为0.01-0.05mol/L，NaCl溶液浓度为0.5-1.5mol/L。
7.如权利要求6所述的IEX -HPLC检测方法，其特征在于：所述A相Tris -HCl溶液为0.02mol/L，B相Tris -HCl&NaCl溶液中Tris -HCl的浓度为0.02mol/L，NaCl溶液浓度为1mol/L。
8.如权利要求1所述的IEX -HPLC检测方法，其特征在于：所述步骤b中阴离子谱柱为聚甲基丙烯酸酯谱柱，所述流动相为A相Tris -HCl溶液和B相Tris -HCl&NaCl溶液的混合液，A相Tris -HCl溶液0.02mol/L；B相Tris -HCl&NaCl溶液中Tris -HCl的浓度为0.02mol/L，NaCl溶液浓度为1mol/L；所述流动相中A相与B相的比例按0、18～22、23～27、28～32时间点，A相与B相体积比为50：50、76：24、50：50、50：50进行梯度洗脱。
9.如权利要求1所述的IEX -HPLC检测方法，其特征在于：所述样品为质粒原液中间产品、成品或其制剂。
10.如权利要求10所述的IEX -HPLC检测方法，其特征在于：所述制剂为水溶液、冻干粉。
权 利 要 求 书1/1页CN 111721871 A
一种质粒超螺旋DNA含量的高分离度检测方法
技术领域
[0001]本发明涉及核酸类药物分析技术领域，特别涉及一种质粒超螺旋DNA含量的IEX-HPLC高分离度检测方法。
背景技术
[0002]质粒是能够自主复制的较小的DNA分子，经过人工改造的工程质粒，可以作为一种药物在患者体内表达插入的目的基因，最终以达到预防或相关疾病的目的。目前质粒DNA已成为下一代生物制药的代表，拟用于基因疫苗及基因。随着临床研究的激增，质粒DNA的需求量也大大增加，这也对质粒DNA的质量提出了要求。
[0003]与其他的寡聚核苷酸一样，质粒对核酸酶及物理剪切力非常敏感，DNA降解会直接影响质粒DNA的质量。2007年，美国FDA发布相关指导原则，将超螺旋结构的DNA占总质粒DNA 的比例作为评价质粒DNA的标准，建议其含量大于80％。据相关研究，超螺旋质粒DNA(sc DNA)相比其它拓扑结构的质粒DNA，在应用中最为有效。这是因为sc DNA的结构经螺旋扭转后，结构极度紧密，更易于进入细胞核；并且sc DNA是唯一适应于在真核细胞中表现生物活性的天然完整结构。所以，获得高含量的sc质
粒DNA十分重要。为了提高质粒的质量，生产工艺过程中尽量避免产生其它拓扑结构的质粒DNA，如开环质粒DNA(oc DNA)、线性质粒DNA(ln DNA)等。在质粒的工艺生产过程中，产生的质粒多联体也会影响质粒质量，同时就超螺旋质粒DNA本身也会存微变构情况。
[0004]在质粒药物分析中所称不同拓扑异构形式的质粒，通常在质粒发酵、原液及制剂生产过程中引入，主要包括超螺旋质粒DNA、开环质粒DNA、线性质粒DNA及多联体质粒DNA。[0005]不同拓扑结构质粒的含量与质粒的发酵过程密切相关，也与菌体的裂解纯化工艺密切相关，工艺过程的任何一个因素的改变都可能导致质粒构型的变化，因而对不同拓扑结构的质粒的检测和控制过程相对复杂。超螺旋DNA含量的检测是控制质粒类生物药品质量的最重要指标之一，其在一定程度上反映了质粒DNA的生物活性。
[0006]然而，现有检测超螺旋质粒DNA的通用方法为电泳法存在一定的缺陷。琼脂糖凝胶电泳重现性和准确度不够好；而毛细管电泳样品处理过程繁琐且成本较高。现有的其他超螺旋质粒DNA分析方法，只对质粒的开环结构进行了分离，其他的DNA构型(线性DNA、多联体DNA等)没有得到有效的分离。同时还没有对超螺旋质粒DNA均一化程度的评价方法。
发明内容
[0007]本发明提供一种高分离度的检测方法，解决将超螺旋质粒DNA与其它拓扑构型质粒DNA有效分离
的问题，其它拓扑构型质粒DNA主要包括开环质粒DNA、线性质粒DNA及多联体质粒DNA，同时可以根据超螺旋DNA分离的峰型判断超螺旋质粒结构的均一化程度，进一步评价超螺旋DNA的质量。
[0008]本发明通过对不对称因子进行比较分析，进一步确定超螺旋质粒均一化程度。[0009]本发明技术方案如下：分离超螺旋质粒DNA与其它拓扑结构质粒DNA，并测定超螺
旋质
[0010]粒DNA比例IEX-HPLC的高分离度检测方法，包括下列步骤：
[0011]a)配制分析溶液
[0012]用Tris-HCl溶液稀释样品，制成分析溶液，溶液浓度为0.25-0.75mg/mL，一定浓度范围的缓冲溶液可以保证样品的稳定性，减低样品中其他因子的干扰性，同时还可以保证阴离子交换洗脱时的稳定性；
[0013]b)谱条件
[0014]谱柱为阴离子交换谱柱；
[0015]以A相Tris-HCl溶液，B相Tris-HCl&NaCl的混合液为流动相，该流动相配制简单，配比容易，批次配制稳定性好。流动相pH范围8.95～9.05；采用NaCl梯度洗脱方法，流速为0.5-1.2ml/min；该洗脱方法是固定NaCl浓度，梯度洗脱的方法，可以使电荷相差不大的DNA 有效的分离，灵敏度较高。柱温为30-40℃，检测过程中采用的检测波长为260nm，由此可以减少蛋白等杂质峰物质的干扰；
[0016]c)上机测定
[0017]取步骤a)制成的分析溶液5-40μl注入高效液相谱仪，进行谱分析，并记录谱图。
[0018]在一些实施例中，所述阴离子交换谱柱的填充剂为聚甲基丙烯酸酯谱柱。[0019]在一些实施例中，所述阴离子交换谱柱的规格为：柱长介于50mm至200mm，谱柱内径介于1mm到10mm，粒径介于1到5μm。选择的谱柱为TSKgel DNA-NPR(4.6mm×75mm，2.5μm)的聚甲基丙烯酸酯谱柱。
[0020]在一些实施例中，所述A相Tris-HCl溶液的浓度为0.01-0.05mol/L、pH 8.95-9.05，优选B相的Tris-HCl&NaCl溶液中Tris-HCl的浓度为0.01-0.05mol/L，NaCl溶液浓度为1mol/L、pH 8.95-9.05。
[0021]步骤b所述阴离子谱柱为聚甲基丙烯酸酯谱柱，所述流动相为B相Tris-HCl溶液和B相Tris-HCl&NaCl溶液的混合液，A相Tris-HCl溶液0.02mol/L，B相Tris-HCl&NaCl溶液中Tris-HCl的浓度为0.02
mol/L、NaCl溶液浓度为1mol/L，所述流动相中A相B相溶液的比例按0、18～22、23～27、28～32时间点，A相B相溶液体积比为50：50、76：24、50：50、50：0进行梯度洗脱，该洗脱条件可以使不同拓扑异构形式的质粒(包括超螺旋质粒DNA、开环质粒DNA、线性质粒DNA及多联体质粒DNA)有效的分离，同时还可以对超螺旋质粒DNA的均一化情况进行评价。
[0022]进一步地，不对称因子范围为1-1.91时，超螺旋质粒DNA均一化程度较高。[0023]所述样品可以为研发及生产涉及的大肠杆菌提取的质粒原液中间产品、成品或其制剂。
[0024]有益效果：
[0025]本发明能够有效的测定，分离质粒DNA样品中多种拓扑结构DNA，尤其实现了谱图中质粒超螺旋结构、降解产生的开环质粒DNA、线性质粒DNA及多聚体质粒DNA的分离，实现了对超螺旋质粒DNA含量的测定，即其对应峰的峰面积百分比，同时还可以对超螺旋质粒DNA的均一化情况进行评价。
[0026]本发明的分析方法对不同拓扑结构的质粒DNA可以进行有效的分离，在超螺旋质
粒DNA的峰中，当不对称因子介于1-1.91时，超螺旋质粒DNA越均一，超螺旋质粒DNA越稳定。当不对称因子大于1.91时，超螺旋质粒DNA均一性差，其中含有较多微变构体，处于不稳定状态，容易逐步降解成其他构型的DNA。上述方法的检测可以确保产品的质量可控，更适用于规模化生产。
附图说明
[0027]图1实例1方法梯度洗脱的谱图，图中1-4分别为开环质粒DNA、线性质粒DNA、超螺旋质粒DNA及多聚体质粒DNA。
[0028]图2实例2方法梯度洗脱的谱图，图中1-4分别为开环质粒DNA、线性质粒DNA、超螺旋质粒DNA及多聚体质粒DNA。
[0029]图3实例3方法梯度洗脱的谱图，图中1-3分别为开环质粒DNA、超螺旋质粒DNA及多聚体质粒DNA。
[0030]图4实例4方法梯度洗脱的谱图，图中1-3分别为开环质粒DNA、超螺旋质粒DNA及多聚体质粒DNA。
具体实施方式
[0031]以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟知的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之
用。
[0032]本申请所述的Tris-HCl是指三羟甲基氨基甲烷与盐酸的缓冲溶液，Tris-HCl& NaCl是指Tris-HCl和氯化钠的混合溶液，IEX-HPLC是指离子交换高效液相谱法。[0033]本发明中指的质粒标准品中超螺旋质粒DNA为稳定的天然状态，未发生微变构。[0034]实施例1
[0035](1)仪器与谱条件
[0036]高效液相谱仪：Agilent 1260infinity高效液相谱系统及工作站；
[0037]谱柱：TSKgel DNA-NPR(4.6mm×75mm，2.5μm)的聚甲基丙烯酸酯谱柱；[0038]配制0.02mol/L的Tris-HCl溶液、浓HCl调节pH至9.0为流动相A相，配制Tris-HCl 和NaCl浓度分别为0.02mol/L和1mol/L的混合溶液，浓HCl调节pH至9.0为流动相B相，流动相中A相-B相的比例按0、20、25、30min时间点，B相体积比为50％、76％、50％、50％，设置流速为1.0mL/min，检测波长为260nm，柱温40℃。
[0039](2)实验步骤
[0040]取大小为3.9KB的质粒标准品(juventas,lot:49443)适量，融化后用Tris-HCl溶液稀释成浓度为0.5mg/mL作为分析溶液；
[0041]取上述分析溶液5μl，注入液相谱仪，记录谱图。结果见附图1，超螺旋质粒DNA、开环质粒DNA、线性质粒DNA及多联体质粒DNA均可分离开，能够到达有效分离。超螺旋质粒DNA含量即为其峰面积百分比。各拓扑结构质粒DNA的出峰时间及峰面积百分比如下表1所示。其中，超螺旋质粒DNA的含量为占比为85.91％。超螺旋质粒峰的不对称因子为1.29，
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