(10)申请公布号
(43)申请公布日 (21)申请号 201510125690.8
(22)申请日 2015.03.20
A61K 8/98(2006.01)
A61K 8/60(2006.01)
A61K 8/44(2006.01)
A61K 8/64(2006.01)
A61Q 19/00(2006.01)
A61Q 19/08(2006.01)
(71)申请人上海辉文生物技术股份有限公司
地址201210 上海市浦东新区沔北路185号
F-2
(72)发明人骆峰 周自华 杨海延
(74)专利代理机构上海弼兴律师事务所 31283
代理人薛琦 沈利
(54)发明名称
(57)摘要
精蛋白提取物及其制备方法。方法如下：(1)取
(2)加入1～10倍体积的水，在温度37～58℃下，
加入水解用生物酶0.1～1.2％，酶解30～300
分钟；(3)将滤液浓缩至30～80％；(4)调节pH
至6.0～8.0上阳离子交换树脂柱，收集流出液，
将合并后的流出液和洗脱液浓缩，乙醇沉淀，收集
沉淀；(5)采用1～5％氯化钠溶液继续洗脱阳离
子交换树脂至流出液无蛋白时，收集洗脱液。所述
鱼精蛋白提取物和鱼精DNA-NA 的提取物收率和
纯度高，可同时获得，不使用具有污染和毒性的物
质。(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书2页 说明书7页CN 106031709 A 2016.10.19
C N 106031709
A
1.一种同时获得鱼精DNA-NA提取物和鱼精蛋白提取物的方法，其特征在于，其包括以下的步骤：
①取鱼精巢，加入水清洗，沥干水分，得到清洗干净的鱼精巢原料；
②向步骤①所得的鱼精巢原料中加入1～10倍体积的水，在温度37～58℃下，加入
0.1～1.2％水解用生物酶，酶解30～300分钟，得酶解后的鱼精巢原料，所述的水解用生物酶为蛋白酶，所述的百分比为占鱼精巢原料的质量百分比；
③将步骤②所得的酶解后的鱼精巢原料过滤，将过滤所得的滤液浓缩至所述滤液原体积的10～80％，即为料液A；
④将步骤③所得的料液A调节pH值至6.0～8.0得料液B，上阳离子交换树脂柱，收集流出液，并用水清洗所述阳离子交换树脂柱，合并流出液和洗脱液，浓缩，用乙醇进行沉淀，收集沉淀，获得鱼精巢提取物Ⅰ，即为鱼精DNA-NA的提取物，所述的水的体积为所述阳离子交换树脂柱体积的2～6倍；
⑤采用1～5％氯化钠溶液继续洗脱所述阳离子交换树脂，洗脱至流出液无蛋白时，停止洗脱，收集洗脱液获得鱼精巢提取物Ⅱ，即为鱼精蛋白的提取物，所述百分比为质量百分比。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤②中，向步骤①所得的鱼精巢原料中加入2～6倍体积的水；所述的温度为45～58℃；所述的水解用生物酶为碱性蛋白酶、复合风味蛋白酶和胰蛋白酶中的一种或多种；所述酶解的时间为180～240分钟；步骤③中，将过滤所得的滤液浓缩至所述滤液原体积的40％～60％；步骤④中，所述料液A调节pH至6.5～7.5；所述的水的体积为所述阳离子交换树脂柱体积的2～
4倍；所述的浓缩为将所述流出液和所述洗脱液浓缩至所述流出液和所述洗脱液原总体积的15％～50％；较佳地浓缩至所述流出液和所述洗脱液原总体积的25％～50％；所述乙醇的终浓度为45％～70％，所述的百分比为乙醇占浓缩至原总体积15％～50％的所述流出液和所述洗脱液与所述乙醇体积之和的百分比；和/或，步骤⑤中，所述的氯化钠溶液为1～2％的氯化钠溶液，所述的百分比为质量百分比。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的制备方法还包括如下的步骤：
⑥取所述的鱼精巢提取物Ⅰ，进行干燥；和/或，
⑦将步骤⑤所得的鱼精巢提取物Ⅱ进行脱味脱处理，干燥。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤⑥中，所述的干燥为喷雾干燥或真空干燥；较佳地，所述干燥的时间为30～120分钟；所述干燥的温度为40～60℃；步骤⑦中，所述的脱脱味处理为活性炭处理；所述的干燥为喷雾干燥或真空干燥；较佳地，所述真空干燥在所述鱼精巢提取物Ⅱ脱脱味后浓缩至膏状时进行；所述干燥的时间为30～120分钟；和/或，所述干燥的温度为40～60℃。
5.一种鱼精DNA-NA的提取物的制备方法，所述的鱼精DNA-NA为鱼精DNA的钠盐，其特征在于，其包括以下的步骤：
①取鱼精巢，加入水清洗，沥干水分，得到清洗干净的鱼精巢原料；
②向步骤①所得的鱼精巢原料中加入1～10倍体积的水，在温度37～58℃下，加入
0.1～1.2％水解用生物酶，酶解30～300分钟，得酶解后的鱼精巢原料，所述的水解用生物酶为蛋白酶，所述的百分比为占鱼精巢原料的质量百分比；
③将步骤②所得的酶解后的鱼精巢原料过滤，将过滤所得的滤液浓缩至所述滤液原体积的10～80％，即为料液A；
④将步骤③所得的料液A调节pH值至6.0～8.0得料液B，上阳离子交换树脂柱，收集流出液，并用水清洗所述阳离子交换树脂柱，合并流出液和洗脱液，浓缩，用乙醇进行沉淀，收集沉淀，获得鱼精巢提取物Ⅰ，即为鱼精DNA-NA的提取物，所述的水的体积为所述阳离子交换树脂柱体积的2～6倍。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法还包括以下的步骤：
取所述的鱼精巢提取物Ⅰ，干燥。
7.一种鱼精蛋白提取物的制备方法，其包括如下步骤：
①取鱼精巢，加入水清洗，沥干水分，得到清洗干净的鱼精巢原料；
②向步骤①所得的鱼精巢原料中加入1～10倍体积的水，在温度37～58℃下，加入
0.1～1.2％水解用生物酶，酶解30～300分钟，得酶解后的鱼精巢原料，所述的水解用生物酶为蛋白酶，所述的百分比为占鱼精巢原料的质量百分比；
③将步骤②所得的酶解后的鱼精巢原料过滤，将过滤所得的滤液浓缩至所述滤液原体积的10～80％，即为料液A；
④将步骤③所得的料液A调节pH值至6.0～8.0得料液B，上阳离子交换树脂柱，收集流出液，并用水清洗所述阳离子交换树脂柱，合并流出液和洗脱液，浓缩，用乙醇进行沉淀，收集沉淀，获得鱼精巢提取物Ⅰ，即为鱼精DNA-NA的提取物，所述的水的体积为所述阳离子交换树脂柱体积的2～6倍；
⑤采用1～5％氯化钠溶液继续洗脱所述阳离子交换树脂，洗脱至流出液无蛋白时，停止洗脱，收集洗脱液获得鱼精巢提取物Ⅱ，即为鱼精蛋白的提取物，所述百分比为质量百分比。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法还包括如下的步骤：
将步骤⑤所得的鱼精巢提取物Ⅱ进行脱味脱处理，干燥。
9.一种鱼精DNA-NA的提取物，其特征在于，所述的提取物包括85～98％核酸和0.1～8％游离蛋白质，所述百分比为质量百分比；所述的提取物的分子量为5000～60万道尔顿。
10.一种鱼精蛋白提取物，其特征在于，85％～98％蛋白质和1～5％核酸，所述百分比为质量百分比；所述鱼精蛋白的提取物中精氨酸含量为50％～70％。
鱼精DNA-NA、鱼精蛋白提取物及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及生物医药领域，具体涉及鱼精DNA-NA、鱼精蛋白提取物及其制备方法。
背景技术
[0002] 成熟雄鱼的精巢组织称鱼精，因具有异味，多被废弃或作废料。但是，鱼精巢中含有大量的鱼精蛋白和鱼精核酸类物质，这两种物质均具有良好的功效。鱼精蛋白(protamine)，是一类碱性蛋白质，其中的精氨酸含量相对较多，精氨酸具有强化肝功能，刺激垂体释放促性腺激素的作用，可男性不育症。同时，鱼精蛋白具有广谱抗菌活性，是一种天然防腐剂，且由于鱼精蛋白完全是天然成分，具有很高的安全性，具有安全、无毒、无副作用的优点，作为一种新型防腐剂，在食品工业中具有广阔的应用前景。
[0003] 鱼精中的核酸类物质(DNA)具有一定的美容功能，作为天然的皮肤保护剂和营养剂，这些有效成分经皮吸收的时候能促进皮肤细胞再生或细胞活化，具有改善皮肤纹理、防止肌肤粗糙、褐斑、雀斑、
皱纹等，达到防止皱纹和美白皮肤的效果。
[0004] 目前关于鱼精蛋白和鱼精DNA制备方法的研究均为两类物质的单独提取工艺，仅仅是针对一种功效成分的提取工艺研究，比如提取鱼精蛋白时必定会舍弃鱼精核酸类物质，提取鱼精核酸类物质时必定会舍弃鱼精蛋白类物质，这对于工业化大生产无疑是很大的浪费。刘红玉等(大马哈鱼鱼精蛋白的提取及抑菌作用的研究，食品科学，2007年第2期
37～39页)采用正交试验法筛选提取鱼精蛋白的最佳工艺条件，其条件为：H
2SO
4
浓度为
7.5％，用量为鱼精的3.5倍(W/W)，提取时间2h，95％乙醇用量为鱼精的3倍(W/W)。对鱼精蛋白进行分析，其蛋白质含量达到89.7％，且精氨酸含量较高。吴燕燕等(淡水鱼精巢核蛋白和鱼精蛋白的提取及营养分析，营养学报，1999年第1期)研究提取淡水鱼精巢中的核蛋白和鱼精蛋白的工艺条件，采用正交试验法筛选，确定了提取蛋白的最佳工艺条件为：NaCl浓度1.0mol/L，NaCl用量为原料量的10倍(W/W)，提取时间1h，95％乙醇用量为料液
量的2倍(W/W)。提取鱼精蛋白的最佳工艺条件为：H
2SO
4
浓度为5.0％，用量为原料量的3
倍(W/W)，提取时间2h，95％乙醇用量为料液量的3倍(W/W)。辛修明等(从河鲀鱼精巢中提取DNA-NA的研究，河北渔业，1994年第5期)采用SDS、苯酚饱和溶液脱蛋白方法，得到大分子量的河鲀鱼DNA-NA产品，其中磷含量8.5％，DNA含量95.05％，蛋白质含量1％，所述的百分比为质量百分比。吴汉民(从鱼精巢中提取高聚NA-DNA的研究，浙江海洋学院学报(自然科学版)，1983年第2期)采用先用酚进行第一次变性，然后再用5％SDS-CHCl
3进行第二次变性的制备工艺，制得的成品，经鉴定达到国际同类产品的质量指标。[0005] 由上可见，现有技术中仅有只针对鱼精蛋白提取物或鱼精DNA的提取方法，造成资源浪费，因此亟需开发新的提取方法。
发明内容
[0006] 本发明所要解决的技术问题是克服了现有鱼精蛋白和鱼精DNA的制备方法往往只能针对其中一种成分进行提取，并且提取工艺中使用有毒物质的缺陷，提供了鱼精
DNA-NA提取物、鱼精蛋白提取物及其制备方法和同步提取两者的制备方法。该制备方法充分利用原料资源，能够同时有效提取多种有效成分，操作步骤简单方便，工艺合理，获得的产品的收率和纯度显著提高，有利于应用于工业化生产。
[0007] 本发明提供一种同时获得鱼精DNA-NA提取物和鱼精蛋白提取物的方法，其包括以下的步骤：
[0008] ①取鱼精巢，加入水清洗，沥干水分，得到清洗干净的鱼精巢原料；
[0009] ②向步骤①所得的鱼精巢原料中加入1～10倍体积的水，在温度37～58℃下，加入0.1～1.2％水解用生物酶，酶解30～300分钟，得酶解后的鱼精巢原料，所述的水解用生物酶为蛋白酶，所述的百分比为占鱼精巢原料的质量百分比；
[0010] ③将步骤②所得的酶解后的鱼精巢原料过滤，将过滤所得的滤液浓缩至所述滤液原体积的10～80％，即为料液A；
[0011] ④将步骤③所得的料液A调节pH值至6.0～8.0得料液B，上阳离子交换树脂柱，收集流出液，并用水清洗所述阳离子交换树脂柱，合并流出液和洗脱液，浓缩，用乙醇进行沉淀，收集沉淀，获得鱼精巢
提取物Ⅰ，即为鱼精DNA-NA的提取物，所述的水的体积为所述阳离子交换树脂柱体积的2～6倍；
[0012] ⑤采用1～5％氯化钠溶液继续洗脱所述阳离子交换树脂，洗脱至流出液无蛋白时，停止洗脱，收集洗脱液获得鱼精巢提取物Ⅱ，即为鱼精蛋白的提取物，所述百分比为质量百分比。
[0013] 步骤①为：取鱼精巢，加入水清洗，沥干水分，得到清洗干净的鱼精巢原料。其中，所述的鱼为本领域常规的鱼，较佳地为选自鲑鱼、鳕鱼和鲣鱼的一种或多种。
[0014] 步骤②为：向步骤①所得的鱼精巢原料中加入1～10倍体积的水，在温度37～58℃下，加入0.1～1.2％水解用生物酶，酶解30～300分钟，得酶解后的鱼精巢原料，所述的水解用生物酶为蛋白酶，所述的百分比为占鱼精巢原料的质量百分比。其中，较佳地，所述的水解用蛋白酶为碱性蛋白酶、复合风味蛋白酶和胰蛋白酶中的一种或多种。较佳地，向步骤①所得的鱼精巢原料中加入2～6倍体积的水。较佳地，所述的温度为45～58℃。较佳地，所述酶解的时间为180～240分钟。
[0015] 步骤③为：将步骤②所得的酶解后的鱼精巢原料过滤，将过滤所得的滤液浓缩至所述滤液原体积的10～80％，即为料液A。其中，较佳地，将过滤所得的滤液浓缩至所述滤液原体积的40～60％。
[0016] 步骤④为：将步骤③所得的料液A调节pH值至6.0～8.0得料液B，上阳离子交换树脂柱，收集流出液，并用水清洗所述阳离子交换树脂柱，合并流出液和洗脱液，浓缩，用乙醇进行沉淀，收集沉淀，获
得鱼精巢提取物Ⅰ，即为鱼精DNA-NA的提取物，所述的水的体积为所述阳离子交换树脂柱体积的2～6倍。其中，较佳地，所述料液A调节pH至6.5～7.5。较佳地，所述的水的体积为所述阳离子交换树脂柱体积的2～4倍。较佳地，所述的浓缩为将所述流出液和所述洗脱液浓缩至所述流出液和所述洗脱液的原总体积的15％～50％；更佳地为25％～50％。较佳地，所述的百分比为乙醇占浓缩至原总体积15％～50％的所述流出液和所述洗脱液与所述乙醇体积之和的百分比。
[0017] 步骤⑤为：采用1～5％氯化钠溶液继续洗脱所述阳离子交换树脂，洗脱至流出液无蛋白时，停止洗脱，收集洗脱液获得鱼精巢提取物Ⅱ，即为鱼精蛋白的提取物，所述百分
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