(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810900518.9
(22)申请日 2018.08.09
地址 215000 江苏省苏州市工业园区星湖
街218号生物纳米园A3楼101B室
(72)发明人 王黔 赵林川
(51)Int.Cl.
G01N 30/02(2006.01)
G01N 30/06(2006.01)
(54)发明名称一种基于高效液相谱法的草酰乙酸含量测定方法(57)摘要本发明公开了一种基于高效液相谱法的草酰乙酸含量测定方法，其原理是草酰乙酸与衍生剂反应后，产生紫外下有吸收的物质，利用高效液相谱法分离，紫外检测器测定其含量。本发明的方法需用到的高效液相谱仪精密度高，可以检测到微克级别的含量，检测灵敏度高。本发明的方法样本前处理过程简单易操作。本发明的提取液成分简单，只需水溶液提取，成本低。本发明的方法的测定步骤都是仪器自动化操作，可以连续检测上百样品，读取准确数据，每一个样品测试时间短。本发明的相对于生物免疫检测方法，价格优势明显， 所需试剂基本无毒。权利要求书2页 说明书4页CN 108645936 A 2018.10.12
C N 108645936
A
1.一种基于高效液相谱法的草酰乙酸含量测定方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
步骤1仪器和用品的准备；
准备高效液相谱仪、低速离心机、超声波清洗器、溶剂抽滤装置、0.45μm水系滤膜、0.45μm有机系滤膜、50个0.22μm水系针头式过滤器、可调式移液器、50个2mL样品瓶、甲醇、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和超纯水；
所述高效液相谱仪包括耐水C18柱和紫外检测器；
步骤2试剂的配制；
1）试剂一：在超纯水中加入盐酸，混匀后加入 EDTA，混匀；
2）试剂二：在超纯水中加入 NaOH，混匀；
3）试剂三：在超纯水中加入盐酸苯肼，混匀；
4）试剂四：在超纯水中加入磷酸氢二钾、磷酸二氢钾，混匀；
5）试剂五：0.5mg草酰乙酸标准品置于1.5 mL EP管中，2-8℃保存；
步骤3实验前的准备工作；
1）将超纯水800 mL和甲醇500 mL采用0.45μm水系滤膜和0.45μm有机系滤膜抽滤，以除去溶剂中的杂质，防止堵塞谱柱；
2）流动相的配制：将磷酸二氢钾和磷酸氢二钾溶于超纯水中，配置成流动相A；流动相B 为纯甲醇；由体积比为95%的所述流动相A和5%的所述流动相B配置成流动相；
3）将配好的所述流动相超声30分钟，以脱去所述流动相中的气泡，防止堵塞谱柱；
步骤4草酰乙酸的提取；
称取0.2g样本，放入研钵中磨碎，加入0.2mL预冷的试剂一，以及0.5mL预冷的超纯水，移入一支EP管内，在4℃下浸提60min，采用离心率10000g，4℃下离心10min，提取上清液；
步骤5草酰乙酸的衍生反应；
取250μL的上述上清液，向其中加入50μL的试剂二，200μL试剂三，175μL试剂四，确保体
系pH在6.8
~7.4之间，在25℃下反应30min，取样上高效液相谱仪测定；
步骤6标准品的配制；
在试剂五中加入1mL超纯水，配成500μg /mL的母液，将所述母液用超纯水分别稀释成100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、10μg/mL和5μg/mL的草酰乙酸标准品溶液；不同浓度的所述草酰乙酸标准品溶液均按照上述衍生条件反应，反应结束后取适量上高效液相谱仪检测；
步骤7 仪器的调试和预设；
1）开启电脑、泵和紫外检测器，安装上耐水C18柱，打开软件，在方法组中设置进样量，流速，柱温，波长以及走样时间，设置完毕保存方法组；
2）用所述流动相过耐水C18柱的柱子，待基线稳定后开始加样；
步骤8样本的测定；
1）在耐水C18柱中分别加入不同浓度的所述草酰乙酸标准品溶液10μL，利用紫外检测器记录不同浓度的所述草酰乙酸标准品的峰面积，用于计算标准曲线；
2）在上述耐水C18柱中加入样品10μL，利用紫外检测器在草酰乙酸衍生物的相应保留时间处检测草酰乙酸衍生物的峰面积；
步骤9 草酰乙酸含量的计算；
以所述草酰乙酸标准品溶液浓度为横坐标，所述草酰乙酸标准品溶液的峰面积为纵坐标计算草酰乙酸标准曲线；将样品峰面积代入所述所述草酰乙酸标准曲线，计算样品中草酰乙酸含量。
2.根据权利要求1所述的基于高效液相谱法的草酰乙酸含量测定方法，其特征在于：步骤1中，所述甲醇为谱级甲醇。
3.根据权利要求1所述的基于高效液相谱法的草酰乙酸含量测定方法，其特征在于：步骤2的试剂一中，超纯水的体积为76mL，盐酸的体积为4mL，EDTA的质量为5mg。
4.根据权利要求1所述的基于高效液相谱法的草酰乙酸含量测定方法，其特征在于：步骤2的试剂二中，超纯水的体积为10mL，NaOH的质量为80mg。
5.根据权利要求1所述的基于高效液相谱法的草酰乙酸含量测定方法，其特征在于：步骤2的试剂三中，超纯水的体积为10mL，盐酸苯肼的质量为80mg。
6.根据权利要求1所述的基于高效液相谱法的草酰乙酸含量测定方法，其特征在于：步骤2的试剂四中，超纯水的体积为10mL，磷酸氢二钾的质量为141.4mg，磷酸二氢钾的质量为51.8mg。
7.根据权利要求1所述的基于高效液相谱法的草酰乙酸含量测定方法，其特征在于：步骤3的2）中，配置流动相A所需的磷酸二氢钾的质量为1.415g，磷酸氢二钾的质量为182.6mg，超纯水的体积为800mL。
8.根据权利要求1所述的基于高效液相谱法的草酰乙酸含量测定方法，其特征在于：步骤7的1）中，所述的方法组中设置的进样量为10μL，流速为1.0mL/min，柱温为25℃，波长为325nm，走样时间为50min。
9.根据权利要求1所述的基于高效液相谱法的草酰乙酸含量测定方法，其特征在于：步骤8的2）中，所述的草酰乙酸衍生物的保留时间为42min。
一种基于高效液相谱法的草酰乙酸含量测定方法
技术领域
[0001]本发明属于生命科学领域领域，具体涉及一种基于高效液相谱法（HPLC）的草酰乙酸含量测定方法。
背景技术
[0002]草酰乙酸是三羧酸循环的一个中间产物，是在苹果酸脱氢酶的催化下由苹果酸生成的，它与乙酰辅酶A缩合生成柠檬酸，开始新的循环。草酰乙酸可在丙酮酸羧化酶的作用下，由丙酮酸与CO2生成；也可在转氨酶的作用下，由天冬氨酸生成。另外，草酰乙酸已知也可作为琥珀酸脱氢酶的抑制剂。
[0003]目前市面上已有的检测草酰乙酸的方法可分为两大类，包括生物免疫检测技术以及高效液相检测技术。生物免疫检测的方法一来容易受到交叉反应的干扰，二来抗体的不通用性以及制备时间较长，整个时间周期很长，价格昂贵。谱技术近些年飞速发展，检测生物体内小分子越来越广泛。但是现在市面上基于高效液相谱检测草酰乙酸的检测技术，鲜有报道，同时对于样品的前处理普遍繁琐，且损失率较高。
发明内容
[0004]为了克服现有技术的缺陷，本发明旨在提供一种基于高效液相谱法的草酰乙酸含量测定方法，不仅前处理过程简单易操作，而且可准确检测草酰乙酸的含量。
[0005]为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：一种基于高效液相谱法的草酰乙酸含量测定方法，其原理是草酰乙酸与衍生剂反应后，产生紫外下有吸收的物质，利用高效液相谱法分离，紫外检测器测定其含量；
该方法的具体包括以下步骤：
步骤1仪器和用品的准备；
准备高效液相谱仪（耐水C18柱，紫外检测器）、低速离心机、超声波清洗器、溶剂抽滤装置、0.45μm水系滤膜、0.45μm有机系滤膜、50个0.22μm水系针头式过滤器、可调式移液器、50个2mL样品瓶、甲醇（谱级）、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和超纯水；
步骤2试剂的配制；
1）试剂一：76mL超纯水中加入4mL盐酸，混匀后加入5mg EDTA，混匀；
2）试剂二：10mL超纯水中加入80mg NaOH，混匀；
3）试剂三：10mL超纯水中加入80mg 盐酸苯肼，混匀；
4）试剂四：10mL超纯水中加入141.4mg磷酸氢二钾，51.8mg磷酸二氢钾，混匀；
5）试剂五：0.5mg草酰乙酸标准品置于1.5 mL EP管中，2-8℃保存；
步骤3实验前的准备工作；
1）将超纯水800 mL和甲醇500 mL采用0.45μm水系滤膜和0.45μm有机系滤膜抽滤，以除去溶剂中的杂质，防止堵塞谱柱；
2）流动相的配制：称量1.415g磷酸二氢钾和182.6mg磷酸氢二钾溶于800mL超纯水中，
配置成流动相A；流动相B为纯甲醇；由体积比为95%的所述流动相A和5%的所述流动相B配置成流动相；
3）将配好的所述流动相超声30分钟，以脱去所述流动相中的气泡，防止堵塞谱柱；
步骤4草酰乙酸的提取；
称取0.2g样本，放入研钵中磨碎，加入0.2mL预冷的试剂一，以及0.5mL预冷的超纯水，移入一支EP管内，在4℃下浸提60min，采用离心率10000g，4℃下离心10min，提取上清液；
步骤5草酰乙酸的衍生反应；
取250μL的上述上清液，向其中加入50μL的试剂二，200μL试剂三，175μL试剂四，确保体
系pH在6.8
~7.4之间，在25℃下反应30min，取样上高效液相谱仪测定；
步骤6标准品的配制；
在试剂五中加入1mL超纯水，配成500μg /mL的母液，将所述母液用超纯水分别稀释成100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、10μg/mL和5μg/mL的草酰乙酸标准品溶液；不同浓度的所述草酰乙酸标准品溶液均按照上述衍生条件反应，反应结束后取适量上高效液相谱仪检测；
步骤7 仪器的调试和预设；
1）开启电脑、泵和紫外检测器，安装上耐水C18柱，打开软件，在方法组中设置进样量10μL，流速1.0mL/min，柱温25℃，波长325nm，走样时间为50min，设置完毕保存方法组；
2）用所述流动相过耐水C18柱的柱子，待基线稳定后开始加样；
步骤8样本的测定；
1）在耐水C18柱中分别加入不同浓度的所述草酰乙酸标准品溶液10μL，利用紫外检测器记录不同浓度的所述草酰乙酸标准品的峰面积，用于计算标准曲线；
2）在上述耐水C18柱中加入样品10μL，所述草酰乙酸标准品溶液可在50min内分离草酰乙酸衍生物，草酰乙酸衍生物的保留时间在42min左右，利用紫外检测器在草酰乙酸衍生物的相应保留时间处检测草酰乙酸衍生物的峰面积；
步骤9 草酰乙酸含量的计算；
以所述草酰乙酸标准品溶液浓度（μg/mL）为横坐标，所述草酰乙酸标准品溶液的峰面积为纵坐标计算草酰乙酸标准曲线；将样品峰面积代入所述所述草酰乙酸标准曲线，计算样品中草酰乙酸含量。
[0006]本发明的有益效果是：
1、本发明的方法需用到的高效液相谱仪精密度高，可以检测到微克级别的含量，检测灵敏度高。
[0007]2、本发明的方法样本前处理过程简单易操作。
[0008]3、本发明的提取液成分简单，只需水溶液提取，成本低。
[0009]4、本发明的方法的测定步骤都是仪器自动化操作，可以连续检测上百样品，读取准确数据，每一个样品测试时间短。
[0010]5、本发明的相对于生物免疫检测方法，价格优势明显，所需试剂基本无毒。[0011] 6. 流动相主要成分为纯水，绿环保，成本低。
[0012]上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明。本发明的具体实施方式由以下实施例详细给出。
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