(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710493447.0
(22)申请日 2017.06.26
(71)申请人 杭州中赢生物医疗科技有限公司
地址 310052 浙江省杭州市滨江区楚天路
88号
(72)发明人 王冶陶 吴忠福 彭昉 刘慧显
王俊俊 俞英豪
(74)专利代理机构 北京品源专利代理有限公司
11332
代理人 巩克栋
(51)Int.Cl.
C12N 5/0783(2010.01)
C12N 5/10(2006.01)
A61K 35/17(2015.01)
A61P 35/00(2006.01)
A61P 35/02(2006.01)A61P 31/04(2006.01)A61P 31/12(2006.01)A61P 31/10(2006.01)A61P 33/00(2006.01)A61P 1/16(2006.01)A61P 31/20(2006.01)A61P 31/18(2006.01)A61P 31/14(2006.01)
(54)发明名称
方法和应用
(57)摘要
本发明涉及细胞免疫领域，
具体涉及一种体外扩增淋巴细胞的培养体系及扩增方法和
介素12和CD80的混合物。采用本发明培养体系扩
增的NK细胞，NK细胞纯度高，对肿瘤细胞杀伤力
强，在第14天可以将NK细胞扩增约9100倍，达到
各种临床适合病症预期疗效应用要求；解决
了临床应用培养体系的安全性问题，有效降低NK
细胞的应用成本，为NK细胞过继免疫的广谱
应用奠定了基础。权利要求书2页 说明书6页 附图2页CN 107177548 A 2017.09.19
C N 107177548
A
1.一种体外扩增淋巴细胞的培养体系，其特征在于，所述培养体系包括：白细胞介素21、白细胞介素12和CD80的混合物。
2.根据权利要求1所述的培养体系，其特征在于，所述白细胞介素21、白细胞介素12和CD8的比例为(1-5):(0.5-3):1，优选为(1-3):(0.8-2):1，进一步优选为2:2:1；
优选地，所述混合物的添加量为10-1000pM，优选为100-800pM，进一步优选为300-500pM。
3.根据权利要求1或2所述的培养体系，其特征在于，所述白细胞介素21、白细胞介素12和CD80为表达在宿主细胞中，优选共表达在同一个宿主细胞中；
优选地，所述白细胞介素12为由白细胞介素12A和白细胞介素12B组成；
优选地，所述宿主细胞为K562细胞。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的培养基，其特征在于，所述培养体系还包括白细胞介素2；
优选地，所述白细胞介素2的添加量为50-400U/mL，优选为80-200U/mL；
优选地，所述培养体系还包括培养液；
优选地，所述培养液为RPMI1640和1-10％人血清或RPMI1640和1-10％胎牛血清。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的培养体系，其特征在于，所述培养体系包括培养液、K562细胞和白细胞介素2；
其中，所述培养液为RPMI1640和1-10％人血清或RPMI1640和1-10％胎牛血清，所述K562细胞包括白细胞介素21、白细胞介素12A、白细胞介素12B和CD80。
6.一种淋巴细胞的扩增方法，其特征在于，利用权利要求1-5中任一项所述的培养体系，以淋巴细胞为原料，进行培养5-10天，补加培养体系，再培养5-10天；
优选地，所述补加培养体系的次数为1-5次，优选为2-3次；
优选地，所述培养的条件为37℃，5％CO2。
7.根据权利要求6所述的扩增方法，其特征在于，所述淋巴细胞为纯化的或未纯化的包含淋巴细胞的细胞组合，优选为外周血单核细胞和/或纯化的NK细胞；
优选地，所述培养体系中的K562工程细胞与所述淋巴细胞的比例为1:(0.25-5)，优选为1:(1-4)，进一步优选为1:(3-4)。
8.一种淋巴细胞的体内扩增方法，其特征在于，将权利要求1-5中任一项所述的培养体系中的白细胞介素21、白细胞介素12和CD80的混合物输入体内或将培养体系中的K562细胞输入体内；
优选地，所述K562细胞中包括白细胞介素21、白细胞介素12和CD80的组合；
优选地，所述输入的剂量为0.1-800pM，优选为0.5-500pM。
9.一种如权利要求6-8中任一项所述的扩增方法扩增的淋巴细胞用于制备肿瘤性疾病和/或传染性疾病的药物。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤性疾病为急性髓细胞性白血病、胶质细胞瘤、前列腺肿瘤、恶性黑素瘤、肾细胞恶性肿瘤、乳腺癌、肺癌或肝癌中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述传染性疾病为细菌、病毒、真菌或寄生虫感染中任意一种或至少两种组合感染的疾病；
优选地，所述传染性疾病为乙型肝炎、丙型肝炎或艾滋病中的任意一种或至少两种的组合。
一种体外扩增淋巴细胞的培养体系及扩增方法和应用
技术领域
[0001]本发明涉及细胞免疫领域，具体涉及一种体外扩增淋巴细胞的培养体系及扩增方法和应用。
背景技术
[0002]NK细胞(自然杀伤细胞，Natural Killer Cell)又称为大颗粒性淋巴细胞。和γδT 细胞，NKT细胞在形式和功能上行使着连接获得性免疫和固有免疫桥梁的作用。一方面，当机体发生感染及创伤时，NK细胞以防御者的身份通过非肽-MHC的识别方式快速，广泛，特异地识别抗原，及时地清除病原微生物，变异细胞，发挥固有免疫的作用。另一方面NK细胞被认为也部分参与了适应性免疫应答，能够影响αβT细胞和B细胞的效应功能。
[0003]在肿瘤的发生发展过程中，NK细胞既可以通过活化性受体直接识别肿瘤细胞并被活化，也可以被辅助细胞(单核细胞，巨噬细胞，树突状细胞等)活化。这些辅助细胞通过其模式识别受体来应答内外环境的变化，再通过分泌多种可溶性因子或直接接触的方式将信号传导给NK细胞。在人类，已经证实存在的可溶性因子有IL12，IL-18，typeI IFN,TNF-α等；直接接触的分子有GITRL/GITR,CD48/2B4，MICA or MICB or ULBP1-ULBP3/NKG2D,AICL/ NKp80等。基于以上原理在体外扩增活化的NK细胞对肿瘤细胞显示出良好的杀伤活性，并应用于肿瘤生物中。
[0004]目前制约NK细胞的临床应用的主要障碍之一就是难以得到足够数量的NK细胞。如何在体外实现NK细胞大规模扩增是目前NK细胞的关键问题。外周血中NK细胞仅占很小的部分。而肿瘤病人的外
周血中往往NK细胞的数量和活性有明显的下降。不同人NK细胞的性质有很大差异。应用嵌合抗原受体(CAR)修饰NK细胞来肿瘤也对NK细胞数量有很高要求。所以寻高效的个性化的NK细胞大规模扩增方法对NK细胞的临床应用有重大意义。[0005]近年，人工抗原提呈细胞(使用基因工程技术制作的滋养层细胞)越来越多的用于NK细胞的体外扩增。比如把膜结合IL15和4-1BBL导入K562细胞，这种方法得到的人工抗原提呈细胞可以将NK细胞在21天平均扩增277倍。把MICA和4-1BBL导入K562细胞，并加以IL15刺激NK细胞可在24天平均扩增550倍.把mIL21，4-1BBL，CD64，CD86，tCD19导入K562细胞，这种方法得到的人工抗原提呈细胞可以将NK细胞3周平均扩增一万倍以上。
[0006]CN 103484429A公开了一种NK细胞的高效制备方法，即通过联合细胞因子和饲养细胞的刺激作用，提高NK细胞的增殖速度和纯度。该发明将NCR3LG1和m IL-15同时转染到K562细胞，m IL-15可以调节NK细胞的活化和增殖，而NCR3LG1作为NK细胞表面主要的活化受体之一NKp30的配体，可以有效的刺激NK细胞活化，且两者有协同作用。再加上游离添加的IL-2和IL-21等因子的刺激，可以在21天的培养时间内，使PBMC细胞数量得到超过500倍的增殖，CD3-CD56+NK细胞的比例超过70％。
[0007]但目前的扩增方法都不能满足临床对NK细胞的大量需求，提供一种快速扩增NK细胞的方法是一个亟待解决的问题。
发明内容
[0008]本发明的目的在于提供一种体外扩增淋巴细胞的培养体系及扩增方法和应用，所述培养体系和方法在提高临床应用安全性同时，有效提升NK细胞培养增殖效率，扩大NK细胞的应用。
[0009]为达到此发明的目的，本发明采用以下技术方案：
[0010]第一方面，本发明提供一种体外扩增淋巴细胞的培养体系，其特征在于，所述培养体系包括：白细胞介素21(IL-21)、白细胞介素12(IL-12)和CD80的混合物。
[0011]本发明中，采用白细胞介素21、白细胞介素12和CD80的混合物来共培养淋巴细胞，使得淋巴细胞中的NK细胞快速增长，能获得高纯度的NK细胞，NK细胞的扩增数量也比使用转染跨膜白介素21和CD137的K562滋养细胞扩增的方法效率提高5.5倍。
[0012]优选地，所述白细胞介素21、白细胞介素12和CD8的比例为(1-5):(0.5-3):1，例如可以是1:0.5:1、1:0.8:1、1:1:1、1:1.5:1、1:2:1、1:2.5:1、1:3:1、2:0.5:1、2:0.8:1、2:1: 1、2:1.5:1、2:2:1、2:2.5:1、2:3:1、3:0.5:1、3:0.8:1、3:1:1、3:1.5:1、3:2:1、3:2.5:1、3: 3:1、4:0.5:1、4:0.8:1、4:1:1、4:1.5:1、4:2:1、4:2.5:1、4:3:1、5:0.5:1、5:0.8:1、5:1:1、5:1.5:1、5:2:1、5:2.5:1或5:3:1，优选为(1-3):(0.8-2):1，进一步优选为2:2:1。[0013]优选地，所述混合物的添加量为10-1000pmol，例如可以是10pmol、20pmol、30pmol、40pmol、50pmol、60pmol、70pmol、80pmol、90pmol、100pmol、150pmol、200pmol、250pmol、300pmol、350pmol、400pmol、450pmol、500pmol、550pmol、600pmol、650
pmol、700pmol、750pmol、800pmol、850pmol、900pmol、950pmol或1000pmol，优选为100-800pmol，进一步优选为300-500pmol。
[0014]优选地，所述白细胞介素21、白细胞介素12和CD80为共表达在宿主细胞中，优选为共表达在同一个宿主细胞中。
[0015]本发明中，发明人发现将白细胞介素21、白细胞介素12和CD80分别表达在不同的宿主中可以刺激淋巴细胞的扩增，将白细胞介素21、白细胞介素12和CD80共表达在同一个宿主细胞中，可以进一步刺激淋巴细胞的扩增，淋巴细胞扩增的数量相比于表达在不同宿主中时增多。
[0016]优选地，所述白细胞介素12为由白细胞介素12A和白细胞介素12B的组成，所述白细胞介素12A和白细胞介素12B表达出来的蛋白会直接结合形成白细胞介素12。
[0017]本发明中，所述白细胞介素21、白细胞介素12和CD80是通过将含有白细胞介素21的基因、白细胞介素12A的基因、白细胞介素12B的基因和CD80基因的不同载体质粒导入宿主细胞得到的。
[0018]本发明中，所述白细胞介素21的基因、白细胞介素12A的基因、白细胞介素12B的基因和CD80基因中的一个氨基酸或多个氨基酸的改变，若不影响蛋白质的性能，都在本申请的保护范围之内。
[0019]本发明中，K562细胞为跨膜白介素21、白介素IL12和CD80的载体。所述载体包括但不仅仅限于
金属、玻璃、塑料、聚合物、脂质体、磷脂双分子层、细胞膜和类似物。重要的是载体表面能够粘附上述蛋白质，并且不影响蛋白质的生物活性。
[0020]优选地，所述白细胞介素21与跨膜蛋白的跨膜区和胞外区相连，共表达为一个融
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