(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010762318.9
(22)申请日 2020.07.31
(71)申请人 山东省农业科学院作物研究所
地址 250000 山东省济南市工业北路202号
(72)发明人 李玮 宋国琦 李根英 李吉虎
李玉莲 张淑娟 张荣志 高洁
(74)专利代理机构 山东知圣律师事务所 37262
代理人 丁奎英
(51)Int.Cl.
C12Q 1/6858(2018.01)
(54)发明名称一种基于KASP技术检测分子标记的方法(57)摘要本发明属于生物技术领域，具体为分子标记检测方法，尤其涉及一种基于KASP技术检测分子标记的方法。所述的分子标记为非SNP和InDels；所述的步骤为：在标记扩增目标DNA序列内部设计KASP引物；对于共显性标记，有两条目标DNA序列，需要设计3条引物，包括2条位点特异引物和1条共用引物；对于显性标记，仅有一条目标DNA序列，需要设计2条引物，包括1条位点特异引物和1条共用引物；所述的位点特异引物的3’端为SNP 位点，引物Tm值比KASP接头序列Tm值高1度以上，扩增片段大小为170±130bp。本发明所述的方法拓宽了KASP技术的检测范围；实现对STS或SCAR 的快速检测。
权利要求书1页 说明书4页序列表3页 附图1页CN 111826426 A 2020.10.27
C N 111826426
A
1.一种基于KASP技术检测分子标记的方法，其特征在于，
所述的分子标记为非SNP和InDels；
包括以下步骤：在标记扩增目标DNA序列内部设计KASP引物；对于共显性标记，有两条目标DNA序列，需要设计3条引物，包括2条位点特异引物和1条共用引物；对于显性标记，仅有一条目标DNA序列，需要设计2条引物，包括1条位点特异引物和1条共用引物；
所述的位点特异引物的3’端为SNP位点，引物Tm值比KASP接头序列Tm值高1度以上，扩增片段大小为170±130bp。
2.根据权利要求1所述的基于KASP技术检测分子标记的方法，其特征在于，所述的分子标记为STS或SCAR。
3.根据权利要求1所述的基于KASP技术检测分子标记的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）寻相似序列：将标记扩增目标DNA序列与参考基因组进行BLAST比对，到基因组中与目标DNA相似度>85%的序列并下载；
（2）重新引物设计：将目标DNA序列和步骤（1）下载的序列进行多序列比对，寻目标DNA独有的SNP或Indel位点用于设计引物，以SNP或Indel位点为3’端，截取KASP位点特异引物；然后在SNP或Indel位点两端寻第二个SNP位点用于设计共用引物，将第二个SNP用于共用引物设计可以增加扩增的特异性；如果不到第二个SNP共用引物，将共用引物设计在无SNP区域；使扩增片段大小在170±130bp，共用引物Tm值与位点特异引物相差小于2度；
（3） KASP检测：采用KASP技术进行PCR反应和荧光检测。
4.根据权利要求3所述的基于KASP技术检测分子标记的方法，其特征在于，所述步骤
（1）中目标DNA序列为野生型或突变体。
5.根据权利要求4所述的基于KASP技术检测分子标记的方法，其特征在于，所述野生型位点特异引物加上FAM接头，在KASP检测结果中为蓝；所述突变体位点特异引物加上Hex 接头，在KASP检测结果中为红；
所述的FAM接头和Hex接头的碱基序列为：
FAM接头碱基序列如SEQ No.1所示；具体序列为：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’；Hex接头碱基序列如SEQ No.2所示；具体序列为：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’。
6.根据权利要求3所述的基于KASP技术检测分子标记的方法，其特征在于，所述步骤
（3）中KASP检测中位点特异引物和共用引物按2：2：5共显性标记或2：5显性标记的比例混合。
权 利 要 求 书1/1页CN 111826426 A
一种基于KASP技术检测分子标记的方法
技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域，具体为分子标记检测方法，尤其涉及一种基于KASP技术检测分子标记的方法。
背景技术
[0002]KASP(Kompetitive Allele-Specific PCR，竞争性等位基因特异性PCR)是基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP(single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性)分型以及检测InDels(Insertions and Deletions，插入和缺失)。该项技术可以对广泛存在于基因组DNA中的SNPs或InDels进行精准的判断，是一种高通量、低成本、低失误率的SNP分型技术。而且KASP标记可避免实验室凝胶电泳，实现自动化、平台化操作，具有高通量、低成本、遗传稳定性好等特点。鉴于此特点，KASP标记目前已经在小麦基因定位、图位克隆及分子标记辅助选择育种中发挥了重要作用。得益于近年来小麦近缘种属植物基因测序信息的不断完善，小麦背景下追踪外缘物质也不断有成功的报道。
[0003]目前用于已知基因辅助选择的分子标记类型主要包括SNP、STS、SCAR等，其中SNP (包括Indel)可以用KASP技术进行检测(Semagn K, Babu R, Hearne S, et al. Single nucleotide polymorphism
genotyping using Kompetitive Allele Specific PCR (KASP): overview of the technology and its application in crop improvement [J]. Mol Breed, 2014, 33: 1-14.)，而STS、SCAR和其他分子标记的检测仍采用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳。凝胶电泳检测一般需要经过凝胶制备、点样、电泳、染和照相等多个步骤，过程复杂且容易出错，花费时间也较长。
发明内容
[0004]为了简化分子标记的检测，实现自动化检测，本专利发明了一种基于KASP技术检测分子标记的方法；分子标记为非SNP和InDels。通过本发明的方法可以扩宽KASP技术的检测范围。且提高非SNP和InDels的分子标记的检测工艺，实现了批量化和自动化检测。[0005]为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种基于KASP技术检测分子标记的方法，所述的分子标记为非SNP和InDels；
包括以下步骤：在标记扩增目标DNA序列内部设计KASP引物；对于共显性标记，有两条目标DNA序列，需要设计3条引物，包括2条位点特异引物和1条共用引物；对于显性标记，仅有一条目标DNA序列，需要设计2条引物，包括1条位点特异引物和1条共用引物；
所述的位点特异引物的3’端为SNP位点，引物Tm值比KASP接头序列Tm值高1度以上，扩增片段大小为170±130bp。
[0006]优选地，所述的分子标记为STS或SCAR。
[0007]上述的方法，具体包括以下步骤：
（1）寻相似序列：将标记扩增目标DNA序列与参考基因组进行BLAST比对，到基因组中与目标DNA相似度>85%的序列并下载；
（2）重新引物设计：将目标DNA序列和步骤（1）下载的序列进行多序列比对，寻目标DNA独有的SNP或Indel位点用于设计引物，以SNP或Indel位点为3’端，截取KASP位点特异引物，然后在SNP或Indel位点两端寻第二个SNP位点用于设计共用引物，将第二个SNP用于共用引物设计可以增加扩增的特异性；如果不到第二个SNP共用引物，将共用引物设计在无SNP区域；使扩增片段大小在170±130bp，共用引物Tm值与位点特异引物相差小于2度；
（3） KASP检测：采用KASP技术进行PCR反应和荧光检测。
[0008]所述步骤（1）中目标DNA序列为野生型或突变体。
[0009]优选地，所述野生型位点特异引物加上FAM接头，在KASP检测结果中为蓝；所述突变体位点特异引物加上Hex接头，在KASP检测结果中为红。
[0010]所述的FAM接头和Hex接头的碱基序列为：
FAM接头碱基序列如SEQ No.1所示；具体序列为：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’；
Hex接头碱基序列如SEQ No.2所示；具体序列为：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’。[0011]所述步骤（3）中KASP检测中位点特异引物和共用引物按2：2：5共显性标记或2：5显性标记的比例混合。
[0012]本发明的有益效果
1、拓宽了KASP技术的检测范围
本发明利用KASP技术体系，可实现分子标记中STS或SCAR等非SNP和InDels的荧光检测。KASP技术是基于SNP创立的技术创立，应用到STS或SCAR中需重新设计引物，并按照相应的比例混合，才能实现STS或SCAR的检测；与凝胶电泳检测相比，普通PCR的反应体系一般大于10μL，而KASP检测的反应体系最低为1μL，可以有效节约试剂，降低成本；
2、时间短且可批量检测
KASP检测具有低成本、简便省时、高精度、高通量的特点，KASP检测效率是基于普通PCR 和凝胶电泳检测的45倍。KASP检测荧光检测384样品仅需42s，而同样的样品数采用凝胶电泳时凝胶制备、点样和电泳过程约需要1小时；采用EB染的凝胶电泳检测精度约为10ng，而KASP采用荧光染料检测精度更高；KASP检测所采用的PHERAstar荧光检测仪可以实现一次放入40块1536孔板进行自动检测功能，
实现了批量化和自动化检测。
附图说明
[0013]图1为实施例1的KASP反应和检测结果图；
图2为实施例2的KASP反应和检测结果图。
具体实施方式
[0014]为便于更好的理解本发明，通过以下实施例加以说明，这些实施例属于本发明的保护范围，但不限制本发明的保护范围。
[0015]实施例1
已报道小麦糯性基因Wx-A1位于7A染体，其分子标记MAG264为共显性STS标记，在野生型264A1a的扩增片段如SEQ No.3所示；具体序列为：CGGCGGTGCCTCTCCATGGTGGTGCGCGCC ACGGGCAGCGGCGGCATGAACCTCGTGTTCGTCGGCGCCGAGATGGCGCCCTGGAGCAAGACTGGCGGCCTCGGCGA CGTCCTCGGGGGCCTCCCCGCCGCCATGGCCGTAAGCTTGCGCCACTGCCTTCTTATAAATGTTTCTTCCTGCAGCC
ATGCCTGCCGTTACAACGGGTGCCGTGTCCGTGCAGGCCAACGGTCACCGGGTCATGGTCATCTCCCCGCGCTACGA CCAGTACAAGGACGCCTGGGACA
在突变体264A1b的扩增片段如SEQ No.4所示；具体序列为：CGGCGGTGCCTCTCCATGGTGG TGCGCGCCACGGGCAGCGGCGGCATGAACCTCGTGTTCGTCGGCGCCGAGATGGCGCCCTGGAGCAAGACTGGCGGC CTCGGCGACGTCCTCGGGGGCCTCCCCGCCGCGGACGCCTTCTTATAAATGTTTCTTCCTGCAGCCATGCCTGCCGT TACAACGGGTGCCGTGTCCGTGCAGGCCAACGGTCACCGGGTCATGGTCATCTCCCCGCGCTACGACCAGTACAAGG ACGCCTGGGACA
用264A1a序列在URGI网站对小麦参考基因组进行blast比对，在7D和4A处到高度相似序列。
[0016]将相似序列下载后利用DNAMAN软件进行多序列比对，确定野生型Wx-A1a的特异SNP为G，突变体Wx-A1b的特异Indel为GGAC。左侧存在高GC含量区域不适合设计引物，向右侧截取序列设计2条位点特异引物，用在线PCR退火温度计算器(www.ab126/ Chemistry/3160.html) 计算截取序列的Tm值（KASP接头Tm值为54度，不同计算方法略有差异），保证特异SNP或Indel为引物3’端不变，通过在5’端增加或删除碱基使KASP位点特异引物WxA-F和WxA-H的Tm值均为55度。在距离位点特异引物约100bp位置设计共用引物WxA-C，Tm值也为55度。扩增片段长度分别为133bp和115bp。
[0017]FAM接头碱基序列如SEQ No.1所示；具体序列为：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’；
Hex接头碱基序列如SEQ No.2所示；具体序列为：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’。[0018]分别在两个位点特异引物5’端加上上述KASP接头，和共用引物一起送公司合成。[0019]所述的接上FAM接头的WxA-F的序列如SEQ No.5所示；所述的接上Hex接头的WxA-H 的序列如SEQ No.6所示；所述的WxA-C的序列如SEQ No.7所示；
WxA-F GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAAGAAACATTTATAAGAAGGCAGTGGC
WxA-H GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAAGAAACATTTATAAGAAGGCGTCC
WxA-C GGCATGAACCTCGTGTTCGTC
合成好后的引物按FAM引物：Hex引物：共用引物=2：2：5比例混合后进行KASP反应和检测，检测结果见图1。其中所述野生型位点特异引物加上FAM接头，在KASP检测结果中为蓝；所述突变体位点特异引物加上Hex接头，在KASP检测结果中为红。
[0020]从图1可以看出，靠近横轴为Wx-A1b（蓝），靠近纵轴为Wx-A1a（红）。
[0021]实施例2
已报导小麦抗秆锈基因Sr2位于3B染体，CAPS分子标记csSr2在我国大部分小麦材料中为显性，与分
子标记SCAR类似。csSr2扩增片段DNA序列如SEQ No.8所示；具体为：CAAGGGTTGCTAGGATTGGAAAACAAAATTGTATTCTTTGTGATTGTAATTGTTTGGTTCAAACATGAATAAA ATAATATTCGATTTTCCATTGCTCTACACAACAAGTGTTCATGATTCTAGAACCCTCAAATGGTCGAGCACAAGCTC TAATTTCTTTGGAATCATGAGTGTTGGATGTCTCGCACACCTAGCTTAATACATGCAGATACTTGTTGGGAAGTAAC GCTGCTAAAGAAACTTATGTATGGTTCTTAGCTAAATTAGGTTTGAGAGGGGCTAATGGTTCTATGTTGTGTAGCTT GCCCAGAAAAATGTAAGATCATAAGAGTTATCT
将其与参考基因组进行BLAST比对，在3D和3B染体到多个高相似度序列，下载后用DNAMAN进行可视化比较在已知SNP位点设计1条位点特异引物Sr2H3如SEQ No.9所示（5’-CGAGCACAAGCTCTAATTTCTTTGG AATCA-3’），Tm值59度，在右侧98bp处到另一个SNP位点，设
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