好氧反硝化菌及其在污水处理和环境修复中的研究进展 作者：丁钰 张婷月 黄民生 何岩 曹承进来源：《华东师范大学学报（自然科学版）》2018年第06期 摘要：好氧反硝化菌由于其可以进行同步硝化反硝化的独特优势，给传统生物脱氮带来了新思路.本文综述了好氧反硝化菌的分离方法、种类及其影响因素，从电子传递瓶颈理论和酶学理论两方面探讨了好氧反硝化作用机理，介绍了它们在污水处理和环境修复方面的应用.研究表明，温度、溶解氧（DO）、碳源、碳氮比和pH值对好氧反硝化过程影响明显，且好氧反硝化菌在适宜条件下都有高效的脱氮效率.不过，目前好氧反硝化菌在環境修复应用方面仍有着效果不稳定等不足，和实验室研究有着一定的差距，需要进一步的探究.系统总结了好氧反硝化菌的分离方法、种类、反应机理、影响因素以及污水处理和环境修复中的应用。 关键词：好氧反硝化菌;生物脱氮;环境生物修复
中图分类号：X522 文献标志码：ADOI：10.3969/j.issn.1000-5641.2018.06.001
引言
污水中含有过量的氮素，导致水体富营养化进而影响水资源利用和水生态安全，所以减少污水中氮排放量，降低水中氮含量是必要的传统生物脱氮方法认为生物脱氮由硝化作用和反硝化作用组成，两个部分相互独立又要协同完成，每一部分所参与的微生物和环境条件完全不同，硝化反应需要自养细菌在好氧条件下完成，反硝化反应需要异养细菌在严格缺氧/厌氧条件下完成.
反硝化是氮素生物地球化学循环的重要环节.长期以来厌养反硝化细菌曾被认为是反硝化过程的唯一承担者.然而，自1980年以来，随着Meiberg等在Hyphomicrobium x氧化二甲胺/三甲胺过程发现具有好氧反硝化功能的菌株以及Robertson等在废水脱硫和反硝化系统中首次分离出一株好氧反硝化菌Thiosphaera pantotropha（现名脱氮副球菌Paracoccusdenitrificans）越来越多的证据表明好氧反硝化菌在生态系统氮素循环中起着不容忽视的作用而且一部分好氧反硝化菌有同步硝化反硝化功能给传统生物脱氮带来了新的思路.本文系统总结了好氧反硝化菌的分离方法、反应机理、影响因素以及污水处理和环境修复中的应用.
1好氧反硝化菌的分离
好氧反硝化菌为专性或兼性好氧细菌，在自然界中含量少，很难成为自然环境中优势菌种，给好氧反硝化菌的分离带来了极大的难度.好氧反硝化菌的分离方法主要有以下几种.
1.1持续曝气法
在细菌的反硝化过程中，硝酸盐（NO-3）和氧气（02）都能作为电子传递过程中电子的最终受体，好氧反硝化菌可以同时利用NO-q和O2.利用该特征，持续往以硝酸盐为单一氮源的反硝化培养基中通入氧气，使细菌处于好氧环境中，氧分子抑制了厌氧条件下发挥作用的酶，使得专性厌氧菌和兼性厌氧菌生命活动受到抑制，从而使好氧反硝化菌在竞争中处于优势地位.Honda等人利用持续曝气法在培养基中曝气一段时间，筛选出一株肠球菌，该菌株可以在有氧条件下进行反硝化脱氮但是这种方法具有筛选时间长、不易于筛选出单一纯化菌种的缺点。
1.2呼吸抑制剂法
呼吸抑制剂法通过在持续曝气的培养基中加入呼吸抑制剂来筛选出好氧反硝化菌.该方法用持续曝气来抑制厌氧和兼性厌氧菌的生长，通过加入某种可以阻断电子流向其他电子受
体的呼吸抑制剂，使电子流向氧气和硝酸盐，来抑制其他好氧菌，从而分离出好氧反硝化菌孔庆鑫等选择（KCN）作为呼吸抑制剂对富集源进行初筛，之后复筛，筛选出一株高效菌Y2-1，在呼吸抑制法中，选择合适的呼吸抑制剂是该方法的关键，由于菌种培养的不同阶段需要的呼吸抑制剂和不同分离源所需要的呼吸抑制剂都可能不同，给分离过程带来了极大的不便.
1.3酸碱指示剂法
酸碱指示剂法是通过在培养基中加入酸碱指示剂反映出菌株生命活动过程中pH变化，来筛选出特定产酸或者产碱的菌.通常应用于筛选好氧反硝化菌的酸碱指示剂是溴百里酚蓝（BTB），BTB的pH变范围是6.0～7.6，颜由黄到绿到蓝.该方法就是利用细菌在反硝化过程中pH值会升高的特点，在好氧条件下用加入了BTB的培养基培养细菌，好氧反硝化菌会在其周围产生一圈蓝光晕，从而将其分离出李秀婷等人用BTB培养基从污水处理池的活性污泥中初筛出22株好氧反硝化菌株.
1.4滴加试剂法
该方法是利用在培养液中滴加格里斯试剂、二苯胺试剂和奈氏试剂，3种指示剂分别能指示亚硝氮、硝氮和氨氮的变化，从而分离出脱氮效率高的反硝化菌株.开始时在以硝氮为唯一氮源的培养基中加入1-2滴格里斯试剂，可以检测亚硝酸盐的存在，如溶液立即变成棕或粉红，说明该溶液中具有好氧反硝化作用的细菌，过程中生成了亚硝酸盐.若无颜变化，再加X-苯胺试剂，若培养液变为蓝，则说明硝酸盐并没有被还原，溶液中无反硝化细菌;若无，则表示硝酸盐和刚生成的亚硝酸盐都被还原成氮氧化物，说明该溶液中具有较强好氧反硝化功能的细菌.周立祥等在好氧条件下采用滴加试剂法，从土壤中分离到3株好氧反硝化菌，均属于假单胞菌属.朱晓宇等采用该方法，分别从水稻土和活性污泥中分离到1株好氧反硝化菌（zW23和ZW27），经鉴定分别为假单胞菌属类产碱杆菌和假单胞菌属门多萨菌，脱氮速率分别达到约21.72和22.31mg/（L.h）.不过这种方法适合筛选反硝化过程中有明显亚硝酸盐积累的菌株，不具有普遍适用性，且在分离精度上有较大的误差.
1.5固液交替培养法
该方法是将液体培养基培养和固体培养基筛选结合，进行多次筛选，不断地划线分离纯化，再通过好氧环境培养，分离出需要的好氧反硝化菌株，再纯化再培养，然后通过测其硝
氮去除率来筛选出具有较高脱氮效率的纯种好氧反硝化菌株.此方法可以筛选出高效的纯菌株，但过程复杂，重复操作多，工作量较大.
以上各方法都有一定的缺陷，现在实验中多采用各方法组合的综合筛选法，可以较快地到高效目标单菌株.Yao等人用BTB培养基在好氧环境中经过固液交替培养分离纯化得到了一株在低温下具有好氧反硝化功能的菌株不动杆菌HA2.黄廷林等用选择培养基通过持续曝气法和逐步驯化培养法从贫营养水源水库中分离出一株好氧反硝化菌A14.
2好氧反硝化菌的种类
好氧反硝化菌的研究从20世纪80年代开始，之后国内外研究者在好氧反硝化领域进行了长期的深入研究，越来越多的新型好氧反硝化菌从自然环境和污水处理系统中分离出来（见表1）.从表1可以看出，很多菌属都具有好氧反硝化能力，例如副球菌属（Paracoccus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、不动杆菌属（Acinetobacters）和芽孢杆菌属（Bacillus）.从近些年国内外的研究报道可以看出，虽然在自然环境中，好氧反硝化菌不是优势菌，但使用合适方法可以进行分离和富集。
3好氧反硝化反应机理
3.1电子传递瓶颈理论
Robertson等在废水脱硫和反硝化系统中首次分离出一株好氧反硝化菌Thiosphaerapantotropha（现名脱氮副球菌Paracoccus denitrificans），随后提出电子传递瓶颈理论来解释好氧反硝化反应机理.他们把研究重点放在细菌的电子传递上，对于传统反硝化细菌的电子传递而言，在细胞素c（Cyt c）和细胞素aa3（cyt aa3）传递中存在传递瓶颈，从而使电子不能同时流向O2和NO-3，而在好氧反硝化过程中，打破了这种瓶颈，使电子可以同时流向O2和NO-3.从而解除了O2对反硝化过程的竞争抑制作用，可以在好氧环境中进行反硝化过程.
随后，Kong等提出了新的好氧反硝化电子传递模型，认为可能存在一条新的电子传递链，该电子传递链可以以醌氢类为电子供体，通过不受氧气抑制的硝酸盐还原酶（Nar）和亚硝酸盐还原酶（Nir）将电子传递给硝酸盐，从而可以在好氧条件下把硝酸盐还原.该发现补充和发展了Robertson等人的电子传递理论.
3.2酶学理论
研究者们尝试从好氧反硝化酶系统来解释好氧反硝化现象，提出了酶学理论.微生物进行反硝化过程需要4种酶：硝酸盐还原酶（Nar）、亚硝酸盐还原酶（Nir）、一氧化氮还原酶（Nor）和一氧化二氮还原酶（Nos），其中硝酸盐还原酶（Nar）包含两种：膜结合硝酸盐还原酶（M-Nar）及周质硝酸盐还原酶（P-Nar）.前者和细胞膜结合，而后者存在于细胞质膜和细胞壁之间.Bell等将分离得到的好氧反硝化菌T.pantotropha分别在好氧条件和缺氧条件下培养，对两种酶进行研究.结果发现膜结合硝酸盐还原酶（M-Nar）只在缺氧或厌氧条件下表达，而周质硝酸盐还原酶（P-Nar）在好氧和缺氧、厌氧条件下均可以表达，其中好氧条件更适宜该酶的表达.实验证明了正是硝酸盐还原酶的种类差异导致了好氧反硝化菌和普通反硝化菌的区别，好氧反硝化的发生是由于周质硝酸盐还原酶（P-Nar）的存在和表达.
和厌氧反硝化菌不同，好氧反硝化菌拥有两种硝酸盐还原酶，使02和NOi可以同时被还原，o2对好氧反硝化过程不再起到竞争抑制作用，好氧反硝化得以实现.
4好氧反硝化的影响因素
好氧反硝化菌由于其独特的优势而被广泛关注，目前对好氧反硝化的研究还处于实验室阶段，人们从自然界中分离出多种好氧反硝化菌，但是由于该类菌对环境要求苛刻及其特殊
性，研究好氧反硝化的影响因素及其优化条件对优化好氧反硝化系统设计及其工程应用显得尤为重要.
一般来说，影响好氧反硝化的因素有温度、溶解氧、碳源、碳氮比和pH值等，这些因素都是影响好氧反硝化菌生长及其反应速率的重要因素.其中，温度是影响所有微生物生长、繁殖及其生理活性的重要因素，有机碳源种类和浓度会影响好氧反硝化的反应速率，在一定范围内碳源浓度的升高会加快好氧反硝化的速率，pH值通过影响酶活性来影响好氧反硝化速率，这些因素对于不同菌种的影响程度不同.
4.1温度
过高和过低温度都会抑制好氧反硝化过程，对于大多数好氧反硝化菌，最适温度范围为25～37°c.Ren等发现对于好氧反硝化菌Acinetobacter sp.YB而言，在37°c下获得的NH+4-N去除率最高，微生物的生长速率也随着温度的升高而升高.但也有特殊情况，一些好氧反硝化菌就不受低温的影响.在已经发现的好氧反硝化菌中，也有少数被证明是嗜低温菌.Yao等发现一株异养硝化一好氧反硝化菌在温度低至10°c时仍能保持相对高的生长速率，没有滞后阶段，且20°c为最适生长温度.从表2可以看出大多数好氧反硝化菌在较宽的温度范围内（25～
37°c）保持着较高的活性和脱氮效率，这有利于好氧反硝化菌在环境中的竞争，在有温度波动的实际废水中更具有应用价值，且嗜低温好氧反硝化菌的发现也为好氧反硝化菌在低温地区的应用打下了基础.
4.2溶解氧（DO）
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