(10)申请公布号
(43)申请公布日 (21)申请号 201510895100.X
(22)申请日 2015.12.08
C12Q 1/44(2006.01)
C12Q 1/68(2006.01)
(71)申请人清华大学
地址100084 北京市海淀区北京市100084
信箱82分箱清华大学专利办公室
(72)发明人何苗 韩世同 施汉昌 周小红
汪用志
(74)专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限
公司 11245
代理人关畅 任凤华
(54)发明名称
法及其应用
(57)摘要
本发明公开了基于8-17 DNAzyme 原理的铅离
子荧光检测方法及其应用。在Pb 2+作用下，8-17 DNAzyme 可以催化断裂其互补底物链，利用固定
在芯片表面的探针捕获断裂后释放到溶液中的带
荧光标记的部分底物链，借助于倏逝波激发捕获
的底物链，建立荧光信号与Pb 2+浓度的关系。本
发明的检测方法可在室温(20-30℃)20分钟完成
Pb 2+的检测，对Pb 2+的最低检测限为20nM。本发明
的检测方法可在室温能够快速、准确地进行饮用
水中铅离子(Pb 2+)的检测，
而且特异性强，不受其它金属离子的干扰，重复性好。本发明的检测方法
具有特异性强、性能稳定、易于再生、检测成本低、
并能与仪器结合的优势。(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书8页 附图3页CN 105296598 A 2016.02.03
C N 105296598
A
1.一种铅离子的检测方法，其特征在于：所述方法利用Pb2+诱导脱氧核酶催化与其互补的底物链发生断裂的原理，在20-30℃使含有Pb2+的待测样品中的Pb2+诱导名称为17EB 的荧光淬灭基团标记脱氧核酶催化与所述17EB互补的名称为17SF的含有所述17EB识别位点的荧光基团标记的单链核酸发生断裂，得
到名称为17SFF的含有荧光基团的所述17SF 的断裂片段，将所述17SFF与表面固定了名称为17PS的探针的芯片进行杂交反应，检测反应后芯片的荧光强度，根据所述荧光强度确定所述待测样品中Pb2+的浓度；
所述17PS中的单链DNA由连接臂和名称为17SFFC的片段组成，所述17SFFC与所述17SFF互补，所述连接臂与所述17SFFC和所述17SFF均不互补。
2.一种铅离子的检测方法，其特征在于：所述方法包括：
1)制备含有17EB-17SF的杂交液；所述17EB-17SF是由名称为17EB的荧光淬灭基团标记脱氧核酶和与所述17EB互补的名称为17SF的含有所述17EB识别位点的荧光基团标记的单链核酸制成的双链DNA，所述杂交液中不含游离状态的所述17SF；
2)在20-30℃，将待测样品与所述含有17EB-17SF的杂交液混合，在Pb2+诱导下，所述17EB催化所述17SF发生断裂，得到含有名称为17SFF的含有荧光基团的所述17SF的断裂片段的反应液，将所述17SFF与表面固定了名称为17PS的探针的芯片进行杂交反应，检测反应后芯片的荧光强度，根据所述荧光强度确定所述待测样品中Pb2+的浓度；
所述17PS中的单链DNA由连接臂和名称为17SFFC的片段组成，所述17SFFC与所述17SFF互补，所述连接臂与所述17SFFC和所述17SFF均不互补。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述含有17EB-17SF的杂交液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为pH7.2-7.4，浓度为10-50mM的Tris-HAc缓冲液；所述溶质为所述17EB-17SF和NaNO
，所述17EB-17SF在所述含有17EB-17SF的杂交液中的浓度为20-50nM，
3
NaNO
在所述含有17EB-17SF的杂交液中的浓度为30-300mM。
3
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述脱氧核酶为8-17DNAzyme。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述荧光淬灭基团在所述17EB 中的位置和所述荧光基团在所述17SF中的位置满足所述17EB与所述17SF能形成所述17EB-17SF。
6.根据权利要求1-5中任一所述方法，其特征在于：所述荧光基团为羧基荧光素FAM、花青素荧光染料Cy3、花青素荧光染料Cy5和花青素荧光染料Cy5.5中任一种；所述荧光淬灭基团为荧光淬灭基团BHQ1，荧光淬灭基团Dabcyl、荧光淬灭基团BHQ2和荧光淬灭基团BHQ3中任一种。
7.根据权利要求1-6中任一所述方法，其特征在于：所述铅离子的检测方法中，所述待测样品为环境样品。
8.根据权利要求1-7中任一所述方法，其特征在于：所述荧光强度通过倏逝波检测仪器进行检测。
9.权利要求1-8中任一所述方法在检测环境样品中铅离子含量中的应用。
基于8-17DNAzyme原理的铅离子荧光检测方法及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物传感器检测重金属离子领域中基于8-17DNAzyme原理的铅离子荧光检测方法及其应用。
背景技术
[0002] 铅污染具有毒性大、致毒剂量低、易累积、难降解、难治理等特点，因而是目前环境监测和治理的重点。《生活饮用水卫生标准》(GB5749-2006)严格限定饮用水中铅(Pb2+)离子浓度不能高于0.01mg/L等。同时GB/T 4470-1998、GB/T 20380.1-2006、GB/T 23362.4-2009等标准就分别规定了使用原子荧光光谱分析法(AFS)、原子吸收分光光度计法(AAS)和电感耦合等离子体质谱分析法(ICP-MS)作
为痕量铅离子检测的标准方法。但是上述方法样品前处理方法复杂，仪器设备昂贵，检测费力、费时、成本高，此外样品必须经专业人员进行操作，难以实现快速的现场检测或对突发水污染事件做出快速响应。[0003] 现代分子生物学研究发现，在分子水平上某些重金属离子可与特异的基因序列发生作用，造成其空间结构发生改变，而这种结构和性能的关系为重金属离子的快速、特异识别提供了一条便捷的途径。脱氧核酶(DNAzyme)由一个碱基环和两条单链侧臂构成，是具有催化功能的单链DNA片段，它是利用体外分子进化技术(SELEX)合成的，具有很高的催化活性和结构识别能力，能将与其互补的DNA链或RNA链连接或切断。
[0004] 2000年，美国伊利诺伊大学香槟分校的Lu教授等人筛选出对铅离子具有高亲和、特异结合的8-17DNAzyme，并设计出一种“turn on”模式的检测策略(即铅离子浓度与荧光强度成正比)快速检测水体中铅离子的浓度。具体方法为在8-17DNAzyme互补底物链(17DS)3’末端标记上了一个荧光基团，而在8-17DNAzyme的5’末端标记一个淬灭基团，当8-17DNAzyme与17DS杂交后，由于荧光基团与淬灭基团相邻，根据荧光共振能量转移(FRET)效应，将不产生荧光；而在铅离子存在下，水溶液中的8-17DNAzyme可对17DS链上的识别位点(一个RNA腺嘌呤)进行攻击，导致17DS断裂，从而使淬灭基团与荧光基团分离，产生荧光，并且荧光的强度与铅离子的浓度成正比。在该体系下Pb2+的线性检测范围为10nM到4mM，检出限远低于EPA(美国环境保护署)饮用水中铅离子含量标准，此外该体系中Pb2+表现出明显的特异性，较其它二价离子灵敏度高出至少80倍，但该体系需要在4℃下反应，严重限制了其应用。
[0005] 中国发明专利申请CN 102031284 A(发明人是赵建龙等)利用EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)碳化二亚胺)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)方法，将3’端修的8-17DNAzyme链固定在芯片表面，并设计开发了“turn off”模式(即铅离子浓饰-NH
2
度与荧光强度成反比)的光学检测Pb2+的方法。他们首先使8-17DNAzyme链与标记有荧光基团的底物链杂化，接着引入Pb2+，在8-17DNAzyme作用下底物链断裂，荧光强度逐渐减弱。该方法耗时1小时，检出限可达1nM，线性范围为1nM-10μM，多次重复再生检测对于灵敏度基本无影响。
[0006] 综上所述，上述研究还存着易产生假信号或者检测时间长的问题，并不能满足实
际检测的需要。因此，研制针对铅离子(Pb2+)检测的快速、准确、灵敏的检测方法已成为防治铅离子(Pb2+)污染的迫切需求。
发明内容
[0007] 本发明所要解决的技术问题是如何在室温(20-30℃)下快速、准确、灵敏的检测饮用水中铅离子(Pb2+)的含量。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种铅离子的检测方法1。
[0009] 本发明所提供的一种铅离子的检测方法1，利用Pb2+诱导脱氧核酶催化与其互补的底物链发生断裂的原理，在20-30℃使含有Pb2+的待测样品中的Pb2+诱导名称为17EB的荧光淬灭基团标记脱氧核酶催化与所述17EB互补的名称为17SF的含有所述17EB识别位点的荧光基团标记的单链核酸发生断裂，得到名称为17SFF的含有荧光基团的所述17SF的断裂片段，将所述17SFF与表面固定了名称为17PS的探针的芯片进行杂交反应，检测反应后芯片的荧光强度，根据所述荧光强度确定所述待测样品中Pb2+的浓度；
[0010] 所述17PS中的单链DNA由连接臂和名称为17SFFC的片段组成，所述17SFFC与所述17SFF互补，所述连接臂与所述17SFFC和所述17SFF均不互补。
[0011] 为解决上述技术问题，本发明还提供了一种铅离子的检测方法2。
[0012] 本发明所提供的一种铅离子的检测方法2，包括：
[0013] 1)制备含有17EB-17SF的杂交液；所述17EB-17SF是由名称为17EB的荧光淬灭基团标记脱氧核酶和与所述17EB互补的名称为17SF的含有所述17EB识别位点的荧光基团标记的单链核酸制成的双链DNA，所述杂交液中不含游离状态的所述17SF；
[0014] 2)在20-30℃，将待测样品与所述含有17EB-17SF的杂交液混合，在Pb2+诱导下，所述17EB催
化所述17SF发生断裂，得到含有名称为17SFF的含有荧光基团的所述17SF的断裂片段的反应液，将所述17SFF与表面固定了名称为17PS的探针的芯片进行杂交反应，检测反应后芯片的荧光强度，根据所述荧光强度确定所述待测样品中Pb2+的浓度；[0015] 所述17PS中的单链DNA由连接臂和名称为17SFFC的片段组成，所述17SFFC与所述17SFF互补，所述连接臂与所述17SFFC和所述17SFF均不互补。
[0016] 上述检测方法1和上述检测方法2中，所述连接臂可位于所述17PS的5’端，所述连接臂由6-10个碱基组成的脱氧核苷酸链(如6个胸腺嘧啶组成的脱氧核苷酸链)组成；所述17PS可进行氨基修饰。
[0017] 上述检测方法1和上述检测方法2中，在Pb2+诱导下，所述17EB催化所述17SF断裂是由于Pb2+满足与所述脱氧核酶的作用条件，可以触发所述17EB对所述17SF的断裂反应，如在所述含有17EB-17SF的杂交液中，在20-30℃条件下Pb2+与所述17EB-17SF作用，导致所述17SF在腺苷酸位点(rA)处被断裂成两部分，得到名称为所述17SFF的含有荧光基团的所述17SF的断裂片段。
[0018] 上述检测方法2中，所述待测样品与所述含有17EB-17SF的杂交液的体积比为≤1％。
[0019] 上述检测方法2中，所述含有17EB-17SF的杂交液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为pH7.2-7.4，浓度可为10-50mM的Tris-HAc缓冲液，具体可为pH7.4，浓度为10mM
，所述17EB-17SF在所述含有的Tris-HAc缓冲液；所述溶质为所述17EB-17SF和NaNO
3
17EB-17SF的杂交液中的浓度可为20-50nM，具体可为30nM；NaNO
在所述含有17EB-17SF的
3
杂交液中的浓度可为30-300mM，具体可为40mM。
[0020] 上述检测方法1和上述检测方法2中，所述脱氧核酶为8-17DNAzyme。
[0021] 上述检测方法1和上述检测方法2中，所述荧光淬灭基团在所述17EB中的位置和所述荧光基团在所述17SF中的位置满足所述17EB与所述17SF能形成所述17EB-17SF，如所述荧光淬灭基团连接在所述17EB的3’末端，所述荧光基团连接在所述17SF的5’末端。[0022] 上述检测方法1和上述检测方法2中，所述荧光基团可为羧基荧光素FAM、花青素荧光染料Cy3、花青素荧光染料Cy5和花青素荧光染料Cy5.5中任一种，具体可为花青素荧光染料Cy3；所述荧光淬灭基团可为荧光淬灭基团BHQ1，荧光淬灭基团Dabcyl、荧光淬灭基团BHQ2和荧光淬灭基团BHQ3中任一种，具体可为荧光淬灭基团BHQ2；具体的，当所述荧光基团为羧基荧光素FAM时，所述荧光淬灭基团为荧光淬灭基团Dabcyl；当所述荧光基团为花青素荧光染料Cy3时，所述荧光淬灭基团为荧光淬灭基团BHQ1或BHQ2；当所述荧光基团为花青素荧光
染料Cy5时，所述荧光淬灭基团为荧光淬灭基团BHQ2；当所述荧光基团为花青素荧光染料Cy5.5时，所述荧光淬灭基团为荧光淬灭基团BHQ3。
[0023] 上述检测方法1和检测方法2中，所述17EB的具体序列如下：5’-ACAGACATCTCTT CTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAGT-B-3’(其中B为荧光淬灭基团BHQ2)。
[0024] 上述检测方法1和检测方法2中，所述17SF的具体序列如下：5-F-ACTCACTATrAG GAAGAGATGTCTGT-3)(其中rA为腺嘌呤RNA；F为荧光基团花青素荧光染料Cy3)。[0025] 上述检测方法1和检测方法2中，所述17PS的具体序列如下：5’-NH
-TTTTTTATAGTGAGT-3’。
2
[0026] 上述检测方法1和上述检测方法2中，所述铅离子的检测方法为非疾病诊断目的铅离子的检测方法。
[0027] 上述检测方法1和上述检测方法2中，所述待测样品可为环境样品，如水，所述水可为饮用水。
[0028] 上述检测方法1和上述检测方法2中，所述荧光强度通过倏逝波检测仪器进行检测，所述倏逝波检测仪器具体可为中国专利ZL200610089497.4的中全光纤倏逝波生物传感器。
[0029] 上述检测方法1和上述检测方法2在检测环境样品中铅离子含量中的应用也属于本发明保护的范围。
[0030] 实验证明，本发明的检测方法可在室温(20-30℃)20分钟完成Pb2+的检测，对Pb2+的最低检测限为20nM。本发明的检测方法可在室温能够快速、准确地进行饮用水中铅离子(Pb2+)的检测，而且特异性强，不受其它金属离子的干扰，重复性好。本发明的检测方法具有特异性强、性能稳定、易于再生、检测成本低、并能与仪器结合的优势。
附图说明
[0031] 图1为基于DNAzyme原理的铅离子的荧光检测方法的原理图。
[0032] 图2为17PS探针芯片对不同浓度铅离子(Pb2+)的检测结果图，其中，a为不同浓度Pb2+的实际检测图；b为Pb2+检测的标准曲线图；
[0033] 图3为17PS探针芯片对不同金属离子的选择性检测结果图。
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