[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公开说明书
[11]公开号CN 1391615A [43]公开日2003年1月15日
[21]申请号00813785.4[21]申请号00813785.4
[22]申请日2000.10.06[30]优先权
[32]1999.10.06 [33]GB [31]9923644.0
[86]国际申请PCT/GB00/03860 2000.10.06
[87]国际公布WO01/25480 EN 2001.04.12
[85]进入国家阶段日期2002.04.02[71]申请人医疗生物系统有限公司
地址英国德文
[72]发明人D·H·丹斯哈姆
[74]专利代理机构中国国际贸易促进委员会专利商标事务所代理人唐伟杰
[51]Int.CI 7C12Q 1/68
权利要求书 2 页 说明书 11 页 附图 1 页
[54]发明名称
[57]摘要
与多核苷酸相互作用并沿其推移的酶的构象变化。
测量构象变化可以通过测量结合在酶上的荧光团的
变化来实现。
00813785.4权 利 要 求 书第1/2页
1.测定多核苷酸序列的方法，其包括以下步骤：
i.在足以诱导酶活性的条件下，使目标多核苷酸与能和多核苷酸相互作用并沿着多核苷酸推移的酶反应；
i i.测定当酶沿着多核苷酸推移时酶的构象变化。
2.根据权利要求1所述的方法，其中酶是聚合酶。
3.根据权利要求1所述的方法，其中酶是解旋酶或者引发酶。
4.根据前述任一权利要求所述的方法，其中酶被固定在固体支持物上。
5.根据权利要求4所述的方法，包含有许多酶固定在固体支持物上。
6.根据前述任一权利要求所述的方法，其中酶含有第一结合可检测标记，其特征随着酶构象的改变而改变。 7.根据权利要求6所述的方法，其中酶含有第二结合可检测标记，该标记能与第一标记相作用，其中相互作用的程度依赖于酶的构象变化。
8.根据权利要求6所述的方法，其中第二可检测标记结合在与酶接触的核苷酸上。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中第一标记是能量受体，第二标记是能量供体，或者相反，并且步骤(ii)通过测量这两个标记之间的能量传递来进行。
10.根据前述任一权利要求所述的方法，其中步骤(ii)通过使用共焦显微术来进行。
11.根据权利要求10所述的方法，其中步骤(ii)通过荧光成像来进行。
12.根据权利要求6所述的方法，其中步骤(ii)通过测量由第一标记的特性改变引起的偏振效应来进行。
13.根据权利要求12所述的方法，其中步骤(ii)通过使用荧光偏
00813785.4权 利 要 求 书 第2/2页振异向术来进行。
14.用荧光共振能量传递方法来检测与目标多核苷酸相互作用并沿其推移的酶的构象变化，从而测定多核苷酸的序列的用途。
15.根据权利要求14所述的用途，其中酶是聚合酶。
16.根据权利要求14或15所述的用途，其中酶是固定在固体支持物上的。
17.用可检测标记的并且能和目标多核苷酸相互作用并沿着其推移的酶，来测定多核苷酸的序列的用途，其中随着酶沿多核苷酸推移，标记会改变它的可检测特性。
18.含有至少一种固定化的、能和目标多核苷酸相互作用并沿其推移的酶的固体支持物，该酶标记有一个或更多的可检测标记。
19.根据权利要求18所述的固体支持物，其中酶是聚合酶。
20.根据权利要求18或19所述的固体支持物，其中标记是荧光团。
21.一种测定多核苷酸序列的系统，其包括权利要求18到21中任一项所述的固体支持物，以及检测标记的设备。
00813785.4说 明 书第1/11页
DNA测序方法
发明领域
本发明是关于多核苷酸序列测定的。
发明背景
测定多核苷酸序列的能力具有巨大的科学重要性。例如，人类基因组计划是一个雄心勃勃的国际性努力，它致力于测定编码在人类基因组中的30亿碱基序列和绘制其图谱。当该计划完成后，产生的序列数据库对生物医学研究来说将是一个空前有力的工具。成功完成这项计划的主要障碍来自于测序方法中所使用的技术。
在D N A大规模测序中，通常使用的主要方法是反应链终止方法。这种方法最初由Sanger和Coulson发展起来(Sanger等人，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1977；74：5463-5467)，它依赖于使用四种三磷酸核苷的双脱氧衍生物，这些物质在聚合酶反应中将掺入新生成的多核苷酸链。一旦掺入，双脱氧衍生物就会终止聚合酶反应，用凝胶电泳将产物分离并加以分析，以揭示特定双脱氧衍生物在链中掺入的位置。
尽管这种方法得到广泛应用，而且能产生可靠的结果，但还是被认为速度慢，劳动强度大以及花费高。
在E P-A-0471732中提出了一种替代的序列测定方法，是用光谱学方法来检测核苷酸掺入与目标互补的新生多核苷酸链的情况。这种方法依赖于固定的模板和引物的复合体，该复合体暴露于只含有不同核苷酸中的一种的流体中。然后用光谱学技术测量依赖于时间的信号，该信号是由聚合酶催化的模板拷贝增加引起的。上述的光谱学技术是表面等离子体激元共振(s u r f a c e p l a s m o n r e s o n a n c e，S P R)光谱法和荧光测量技术，前者是在损耗波场内测量分析物中的变化。但是，
00813785.4说 明 书 第2/11页人们也认识到了这种方法的局限性；对S P R技术来说，最严重的在于：当拷贝链大小增加时，由于链的移动超出了损耗波场，也会引起信号绝对值的增加，从而导致检测增量变得更加困难。荧光测量技术有一个缺点，即由掺入延长中的新生多核苷酸链的荧光团引起的背景干扰增加。随着链的增长，背景“噪音”也增加，检测每个核苷酸掺入情况所需的时间也需要增加。这严重的限制了这种方法在大分子量多核苷酸测序中的应用。
在W O-A-9924797和W O-A-9833939中描述了单片断多核苷酸测序方法，两者都利用荧光检测标记的单核苷酸分子。这些单核苷酸是在核酸外切酶分子的作用下，从被光阱(o p t i c a l t r a p)束缚在液流中的模板多核苷酸上切割下来(J e t t等人，J.B i o m o l.S t r u c.D y n，1989；7：301-309)。接着，这些切割下来的核苷酸在石英流室内往下流，受到激光激活，然后由灵敏的检测系统来检测。但是，人们认识到了这种方法的局限性；这种核酸外切酶技术最严重的缺点是标记的核苷酸严重影响了核酸外切酶的处理能力。这种方法的另外一些局限性包括核苷酸会“粘在”用来固定多核苷酸片断的生物素小珠上，从而
导致核苷酸流变成不同步的；初始酶标记过程的低效率和长度限制；以及这四种不同染料分子之间的交叉激活导致的错误率急剧增加。 因此就有必要有一种改进的方法—最好是在单个片断水平上—来测定多核苷酸的序列，这种方法能极大地增加检测多核苷酸的速率以及片断大小，该方法优选由自动化的方法来执行，从而减少现存方法的复杂性和成本。
发明概述
本方法基于以下认识：目标多核苷酸的序列可以通过测量结合并且沿着目标多核苷酸推移的酶的构象变化来测定。依目标多核苷酸上与酶接触的单个核苷酸的不同，所产生的构象变化的程度也是不同的。 根据本发明的一个方面，测定多核苷酸序列的方法包括以下步骤： (i) 在足以诱导酶活性的条件下，让目标多核苷酸与能和目标
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