(10)申请公布号 CN 102229916 A
(43)申请公布日 2011.11.02C N 102229916 A *CN102229916A*
(21)申请号 201110163914.6
(22)申请日 2011.06.17
CGMCC No.4905 2011.05.30
C12N 7/00(2006.01)
A61K 39/12(2006.01)
A61P 31/14(2006.01)
C12R 1/93(2006.01)
(71)申请人福建省农业科学院畜牧兽医研究所
地址350013 福建省福州市晋安区新店埔档
(72)发明人黄瑜 傅光华 万春和 施少华
程龙飞 陈红梅 林芳 林建生
(74)专利代理机构福州元创专利商标代理有限
公司 35100
代理人蔡学俊
(54)发明名称
(57)摘要
于兽医传染病学领域。本发明的鸡黄病毒为鸡黄
病毒（ChickenFlavivirus ）FQ-C1株，已于2011年
5月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通
微生物中心保藏，保藏登记号为CGMCC No.4905。
鸡黄病毒FQ-C1株接种SPF 鸡胚，收集接毒后死亡 的SPF 鸡胚尿囊液，将SPF 鸡胚尿囊液经甲醛灭活
加入白油佐剂进行乳化，制备成常规的油乳剂灭
活疫苗。本发明制备的鸡黄病毒灭活疫苗不会对
鸡只产生任何不良反应，实验安全性高，该疫苗能
够有效控制鸡黄病毒病，使目前我国大量养鸡生
产者减少损失、提高养殖效益。
(83)生物保藏信息(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页
1.一种鸡黄病毒，其特征在于：所述鸡黄病毒为鸡黄病毒（Chick Flavivirus）FQ-C1株，已于2011年5月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏登记号为CGMCC NO.4905。
2.根据权利要求1所述的鸡黄病毒，其特征在于：所述鸡黄病毒FQ-C1株的分离如下：
（1）病毒的分离培养：从表现产蛋异常的蛋鸡中无菌采集其出血卵泡，按常规方法匀浆、反复冻融4次，4℃条件下12 000 r/min离心10 min，无菌条件下吸取上清液，冻存备用； （2）病原禽胚分离培养：将步骤（1）分离的毒株经SPF鸡胚连续传4代，得到的SPF鸡胚适应毒株即为所述鸡黄病毒FQ-C1株。
3.权利要求1或2所述的鸡黄病毒在制备鸡黄病毒灭活疫苗中的应用。
4.一种鸡黄病毒灭活疫苗，其活性成分为灭活的权利要求1或2所述的鸡黄病毒。
5.一种鸡黄病毒灭活疫苗的的制备方法，其特征在于：将权利要求1或2所述的鸡黄病毒FQ-C1株接种SPF鸡胚，收集接毒后死亡的SPF鸡胚尿囊液，将SPF鸡胚尿囊液经甲醛灭活加入白油佐剂进行乳化，制备成常规的油乳剂灭活疫苗。
一种鸡黄病毒及其灭活疫苗
技术领域
[0001] 本发明涉及一种鸡黄病毒及其灭活疫苗，属于兽医传染病学领域。
背景技术
[0002] 2010年8月以来，我国福建、广东、山东等地的蛋鸡或（和）种鸡发生一种以采食量和产蛋率迅速下降及低死亡为特征的疫病，俗称为鸡产蛋骤降症，鸡黄病毒病。患病的高产蛋率（如85%以上）蛋鸡和种鸡，发病后4~5天从产蛋率迅速下降至20%~30%，严重的于发病后7~10天停产。据不完全统计，该病自发生以来对我国养鸡业造成的经济损失高达3000万元。由于该病为新发疫病，目前国内外尚无预防该病的疫苗。
发明内容
[0003] 本发明的目的在于提供一种鸡黄病毒及其灭活疫苗，该疫苗能够有效控制鸡黄病毒病，使目前我国大量养鸡生产者减少损失、提高养殖效益。
[0004] 本发明的鸡黄病毒（Chick flavivirus）FQ-C1株，已于2011年5月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其简称CGMCC，保藏登记号为CGMCC NO.4905。
[0005] 本发明的显著优点：
本发明首次提出了用鸡黄病毒FQ-C1株制备针对鸡黄病毒的灭活疫苗，该疫苗的研究和制备解决了我国当前该病无法进行有效预防的缺陷，可有效解决当前鸡黄病毒发病率高、造成鸡只产蛋骤降的损失。用鸡黄病毒FQ-C1株制备灭活疫苗，工艺简单、操作方便，且制备出的疫苗抗原性好、安全性高，对外界环境无任何不良影响，容易通过安全评价。[0006] 本发明制备的鸡黄病毒灭活疫苗不会对鸡只产生任何不良反应，实验安全性高，而且对免疫鸡只体内能够诱导高水平的中和抗体，说明免疫后鸡只能够有效抵抗鸡黄病毒病毒的攻击。
[0007] 目前，鸡黄病毒病在我国的福建、广东、山东等省均有流行，该疫苗的制备、生产、应用和普及将为我国有效防控该病提供有力保障。
附图说明
[0008] 图1为FQ-C1株病毒PCR鉴定；其中1、 DNA 分子量；2、黄病毒；3、AIV； 4、EDSV；
5、 NDV；
6、IBV；
7、ARV；
8、ILTV；
9、IBDV； 10、阴性对照；
图2为病毒系统进化分析。
具体实施方式
[0009] 实施例1
本发明的鸡黄病毒FQ-C1株，是通过如下方式获得的：
于2010年12月，福清市某蛋鸡场210日龄的蛋鸡发生急性的严重产蛋下降，但未见
鸡只死亡，使用抗菌药物和抗病毒药物无明显效果。我们通过捕杀致死的发病蛋鸡组织中分离到1株病毒，通过实验室检测排除了禽流感病毒、鸡产蛋下降综合征病毒、鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡关节炎病毒、鸡传染性法氏囊病毒，经黄病毒特异性RT-PCR鉴定及测序分析表明，FQ-C1株病毒为为黄病毒科黄病毒属病毒。
[0010] （1）病料的处理：从表现产蛋异常的蛋鸡中无菌采集其出血卵泡，按常规方法匀浆、反复冻融3次，4℃，12 000 r/min离心10 min，取上清液，-80℃冻存备用。
[0011] （2）病原禽胚分离培养：将匀浆的病料经尿囊腔接种9日龄SPF鸡胚3枚，每枚0.2 mL，接种后置37℃下恒温孵化，连续观察7天。结果，SPF鸡胚接种病料后第3天全部死亡，经无菌检查为阴性。以SPF鸡胚传接4代，均可100%致死，获得的病毒SPF鸡胚适应毒株即命名为FQ-C1株。
[0012] （3）FQ-C1株病毒的鉴定
分别经禽流感病毒、鸡产蛋下降综合征病毒、鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡关节炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡传染性法氏囊病毒、鸭黄病毒特异性PCR或RT-PCR扩增后，只有鸭黄病毒特异性RT-PCR扩增阳性，且扩增目的片段大小与预测的相符，为400bp（见图1）；目的条带经胶回收
后克隆至pMD18-T载体，通过测序后以Blast进行比较分析，该株病毒与文献（万春和，施少华，程龙飞，陈红梅，傅光华，张大丙，林芳，林建生，黄瑜.一种引起种（蛋）鸭产蛋鄹降新病毒的分离与初步鉴定；福建农业学报，2010,25（6）：663-666.）报道的种（蛋）鸭黄病毒同源性高达97.1%，在系统进化树上处于同一分支（见图2）；而与黄病毒科黄病毒属代表株坦布苏病毒同源性为87%。以上结果表明，分离于产蛋率骤降的蛋鸡中的FQ-C1株病毒为黄病毒科黄病毒属病毒，即为鸡黄病毒。
[0013] （4）病毒的SPF鸡胚传代
将获得的FQ-C1株病毒在SPF鸡胚中连续传代20代，每隔5代次测定一次病毒的ELD
，
50结果表明该病毒能在SPF鸡胚中稳定增殖，对SPF鸡胚的致死时间稳定在80h左右。[0014] 实施例2
本发明的鸡黄病毒灭活疫苗，是通过如下方式获得的：
将鸡黄病毒FQ-C1株接种SPF鸡胚，收集接毒后死亡的SPF鸡胚尿囊液，其中鸡黄病毒
/0.2ml，将SPF鸡胚尿囊液经甲醛灭活加入白油佐剂进行乳FQ-C1株的含量为103.33ELD
50
化，制备成常规的油乳剂灭活疫苗。
[0015] 制备的灭活疫苗的免疫结果如下：
1、疫苗安全性试验
1.1 SPF雏鸡安全性试验
购进1日龄SPF雏鸡60羽，饲养到7日龄时随机分成4组，每组15羽，3组实验组SPF 鸡分别经腿部肌注不同批次（共3批）的鸡黄病毒灭活疫苗，一次单剂量接种1mL/羽；第4组为对照组，注射灭菌生理盐水。对实验组SPF雏鸡与对照组SPF雏鸡连续观察14天，观察有无发病、死亡和体重变化。结果3个实验组SPF雏鸡和对照组SPF雏鸡体重无差异，均无发病、死亡，扑杀后均无肉眼可见病变。
[0016] 1.2 蛋鸡安全性试验
从非疫区经检测鸡黄病毒抗体阴性的健康产蛋鸡（220日龄、4100只、产蛋率为94%
左右）选取120只，饲养1周后（此时产蛋率为93.33%）随机分成4个组，每组30只，其中3组实验蛋鸡分别经胸部肌注不同批次的鸡黄病毒灭活疫苗，一次单剂量接种3mL/只；第4组为对照组，经胸部肌注灭菌生理盐水3mL/只。连续观察14天，观察各组蛋鸡有无产蛋量下降、发病、死亡。结果3个实验组蛋
鸡和对照组蛋鸡于注射疫苗或生理盐水后4天内平均产蛋率分别下降9.13%、9.13%、8.33%、8.33%，第5天后逐渐正常，四组间无差异，且均无发病、死亡，观察期满扑杀后均无肉眼可见病变。
[0017] 2、疫苗免疫效果试验
从非疫区经检测鸡黄病毒抗体阴性的健康产蛋鸡（220日龄、4100只、产蛋率为94%左右）选取150只，饲养1周（此时产蛋率为93.33%）后随机分成A、B、C、D、E五个组，每组30只，其中A、B、C三个组实验蛋鸡分别经胸部肌注不同批次（共3批）的鸡黄病毒灭活疫苗，一次单剂量免疫接种1mL/只；第D、E两个组为对照组，经胸部肌注灭菌生理盐水1mL/只。连续观察28天（此时A、B、C、D、E各组蛋鸡产蛋率分别为96.67%、93.33%、93.33%、96.67%、96.67%）后，A、B、C、D四组蛋鸡分别经胸部肌注攻以FQ-C1株鸡黄病毒1mL/只；E组作为空白对照蛋鸡，经胸部肌注灭菌生理盐水1mL/只。连续观察14天，观察各组蛋鸡有无产蛋量下降、发病、死亡。
[0018] 结果A、B、C 三个实验组蛋鸡和E组空白对照组蛋鸡于攻毒或注射生理盐水后4天内平均产蛋率分别为83.33%、83.33%、80%、86.67%，分别下降了13.34%、10%、13.33%、10%，第5天后逐渐正常，四组间无差异，且观察期内均未见发病、死亡，观察期满扑杀后均无肉眼可见病变。而D组蛋鸡于攻毒后第1、2、3、4天产蛋率分别为83.33%、43.33%、16.67%、6.67%，4天内平均产蛋率为37.5%，下降了59.17%；第5天起停产。在观察期内未见蛋鸡死亡，但观察期满扑杀后可见卵泡出血，卵黄囊水肿增厚或破裂，卵黄液化、混浊。
[0019] 结果表明，本发明的疫苗对预防鸡黄病毒病有较好的保护效果。
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