(10)申请公布号 CN 102809656 A
(43)申请公布日 2012.12.05C N 102809656 A
*CN102809656A*
(21)申请号 201210304912.9
(22)申请日 2012.08.26
G01N 33/68(2006.01)
G01N 33/561(2006.01)
(71)申请人云南沃森生物技术股份有限公司
地址650106 云南省昆明市高新技术开发区
(72)发明人黄镇 吴凯 樊会兰 张胜祥
马波 陈磊 白梅 金栋 郭秋岑
熊波 胡东梅 王会梅
(74)专利代理机构昆明合众智信知识产权事务
所 53113
代理人康珉
(54)发明名称
多糖含量的测定方法
(57)摘要
本发明涉及一种脑膜炎球菌多糖结合疫苗成
品各游离多糖含量的测定方法，属于生物技术
领域。该方法在检品供试品的制备中进行蛋白酶
K 处理，加入的蛋白酶K 量为酶解反应体系中蛋白
的含量的2～8倍，
还用冷酚处理即用乙酸钠饱和冷酚溶液分离结合物中结合多糖与游离多糖，与
免疫电泳检测技术联合使用测得结合疫苗成品各
游离多糖的含量。本发明方法消除了各结合
物载体蛋白在免疫电泳中对电泳迁移率等相关因
素的影响，有效地分离了结合物中结合多糖与游
离多糖，建立了检测4个以上脑膜炎球菌多糖
结合疫苗成品各游离多糖的适宜检测体系，具
有耐用性强、准确性及精密度高的特点，建立了评
价4个以上脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品质量
的方法。
(51)Int.Cl.权利要求书2页 说明书22页
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书 2 页 说明书 22 页
1.一种脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品各游离多糖含量的测定方法，包括以下步骤：
（1）检品供试品的制备
①预处理：取待测的4个以上的脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品用注射用水按标示量复溶，取5.0ml于超滤杯中，5000～10000×g离心超滤20～40min，收集浓缩液，补注射用水至总体积为1.0ml，得超滤浓缩
液；用Lowry法测定该超滤浓缩液中蛋白的浓度；
②蛋白酶K处理：酶解反应体系总体积为420µl，以所述的酶解反应体系总体积为基准，取1/6体积的超滤浓缩液，加入1/10体积的蛋白酶K缓冲液，蛋白酶K，加入的蛋白酶K 的量为酶解反应体系中蛋白的含量的2～8倍，并补加注射用水至420µl，混匀后于37℃孵育6小时±2小时，即得检品供试品原液JY；
③冷酚处理：另取超滤浓缩液0.6ml，按超滤浓缩液与乙酸钠饱和冷酚溶液的体积比为1：2～3，加入乙酸钠饱和冷酚溶液，振荡混匀10～30 min，置冰浴5～20 min，8000～10000rpm，8℃离心10～30分钟，收取上清液，即得检品供试品上清液JS；
（2）对照供试品的制备
①预处理：取所述的4个以上的脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品预测定对应的多糖，用注射用水将该多糖稀释至多糖浓度为60µg/ml；
②蛋白酶K处理：取步骤（2）①中60µg/ml的多糖溶液，按步骤（1）中②相同的方法处理，得对照供试品原液DY；
③冷酚处理：将步骤（2）①中60µg/ml的多糖溶液用注射用水稀释至10µg/ml，取
0.6ml，再按步骤（1）中③相同的方法处理，得对照供试品上清液DS；
（3）抗血清琼脂糖胶板的制备
称取琼脂糖，加入pH8.6的电泳缓冲液使胶浓度为1.5%，加热溶胀完全，放56℃水浴10～30min，加入预测定对应的效价为1：640的特异性抗血清，该抗血清的量为琼脂糖溶液体积的3%，混均后立即铺板、在抗血清琼脂糖胶板的一端打一排孔；
（4）上样
待抗血清琼脂糖胶板凝固后，在其中一个孔加入溴酚蓝指示剂，然后在其余各孔依次分别加入预测定对应的4个以上已知不同浓度的多糖标准品、JY、 DY、JS、DS ，加入量均为7µl/孔；
（5）电泳及胶片处理
按常规方法进行电泳、干胶制备、染和脱处理；
（6）结果计算
①用游标卡尺量取预测定对应的各多糖标准品、JY、 DY、JS、DS的峰高值，以各浓度多糖标准品浓度对数为横坐标，对应峰高值为纵坐标作回归曲线，将JY、 DY、JS、DS的峰高值代入回归曲线分别计算JY、 DY、JS、DS的多糖含量；
②根据如下公式计算有效性P：
；
③根据如下公式计算预测定中游离多糖含量H：
。
2. 根据权利要求1所述的脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品各游离多糖含量的测定方法，其特征在于：步骤（4）所述的预测定对应的4个以上已知不同浓度的多糖标准品是预测定对应的浓度分别为2.5µg/ml、5µg/ml、10µg/ml、20µg/ml、40µg/ml的5个多糖标准品。
3.根据权利要求1或2所述的脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品各游离多糖含量的测定方法，其特征在于：步骤（1）和步骤（2）所述的4个以上的脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品为A、C、Y、W135脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品。
一种脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品各游离多糖含量的测
定方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，更具体涉及一种脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品各游离多糖含量的测定方法。
背景技术
[0002] 奈瑟氏脑膜炎球菌（n.meningitidis），简称脑膜炎球菌，脑膜炎球菌感染是引起儿童细菌性脑膜炎的常见病因，病死率较高。由于脑膜炎球菌荚膜多糖疫苗的使用，有效地控制了发病率。但是，荚膜多糖属T细胞非依赖性抗原，再次免疫不能被加强，且不能诱导2岁以下儿童产生免疫应答，有一定的局限性。以化学方法将蛋白载体共价结合到荚膜多糖上，可以使之成为T细胞依赖型抗原，从而具有免疫记忆反应，因此对5岁以下婴幼儿提供免疫保护。
[0003] 研究表明，A脑膜炎球菌多糖—白喉毒素无毒变异蛋白结合物、C脑膜炎球菌多糖—白喉毒素无毒变异蛋白结合物、Y脑膜炎球菌多糖—白喉毒素无毒变异蛋白结合物、W135脑膜炎球菌多糖—白喉毒素无毒变异蛋白结合物在小鼠中具有很强的免疫原性，可刺激小鼠产生高水平的IgG，而单独的荚膜多糖不能刺激小鼠产生抗体或仅有低水平抗体产生。可见结合物中真正起作用的是与白喉毒素无毒
变异蛋白结合的多糖，多糖结合疫苗中的游离多糖含量超过规定的限度会对疫苗临床使用的效果产生不利的影响，因此多糖蛋白结合物中游离多糖含量测定是多糖结合疫苗质量控制中的关键指标之一，也是反映结合疫苗质量的优劣的主要指标之一。
[0004] 因为不同细菌荚膜多糖以及不同多糖结合物性质差异较大，对于单独结合物原液中游离多糖含量，A可采用冷酚处理后通过测定磷含量获得，C、Y或W135也可采用冷酚处理后通过测定唾液酸含量获得；A+C结合疫苗各游离多糖含量也可分别通过前述测A 的磷含量和C的唾液酸含量而获得，而在A、C、Y、W135结合疫苗成品中A、C、Y、W135结合物混合在一起，且C、Y、W135均含有唾液酸，故无法通过测唾液酸含量获得C、Y、W135各游离多糖含量，由于在生产3个以上的多糖结合疫苗成品过程中存在诸多影响因素，且A、C、Y或W135游离多糖的稳定性各不相同，而各游离多糖含量的高低与结合疫苗成品中对应抗原对机体免疫原性的好坏密切相关，从而影响最终产品的免疫保护效果，故需要对A、C、Y、W135脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品各游离多糖含量进行分别测定，以保证最终产品的质量。
[0005] 《火箭免疫电泳法定量检测4价脑膜炎球菌多糖疫苗中C脑膜炎球菌多糖含量的方法学验证》（林云等，发表国际生物制品学杂志2008年12月第31卷第6期）中介绍了一种检测4价脑膜炎球菌多糖疫苗中C脑膜炎球菌多糖含量的方法，解决了测定A、C、Y、W135脑膜炎球菌多糖疫苗成品各多糖含量的技术问题，但该方法不适用于测定结合疫苗成品中各多糖含量，因为实验证明，结合疫苗中
各结合物的载体蛋白会对火箭免疫电泳产生影响，导致结果不能真实准确地反映多糖含量，故3个以上的多糖结合疫苗成
品包括A、C、Y、W135脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品各游离多糖含量的测定是一个技术难点，目前尚无该类多糖结合疫苗成品各游离多糖含量测定的通用方法，需建立一种方法准确测定该类多糖结合疫苗成品中A、C、Y、W135等各的游离多糖含量。
[0006] 抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。这种反应即可在机体内进行，也可以在机体外进行。抗原抗体反应的特点主要有三性：即特异性、比例性、可逆性。特异性，是抗原抗体反应的最主要特征，这种特异性是由抗原决定簇和抗体分子的超变区之间空间结构的互补性确定的。这种高度的特异性在传染病的诊断与防治方面得到有效的应用。随着免疫学技术的发展进步，还将在医学和生物学领域得到更加深入和广泛的应用，比如肿瘤的诊断和特异性等。比例性，是指抗原与抗体发生可见反应需遵循一定的量比关系，只有当二者浓度比例适当时才出现可见反应，在抗原抗体比例相当或抗原过剩或抗体过剩的情况下，反应最彻底，形成的免疫复合物沉淀最多、最大。而当抗原抗体比例超过此范围时，反应速度和沉淀物量都会迅速降低甚至不出现抗原抗体反应。可逆性，是指抗原抗体结合形成复合物后，在一定条件下又可解离恢复为抗原与抗体的特性。由于抗原抗体反应是分子表面的非共价键结合，所形成的复合物并不牢固，可以随时解离，解离后的抗原抗体仍保持原来的理化特征和生物学活性。
[0007] 火箭免疫电泳技术又称作单向电泳扩散免疫沉淀试验，它是由单向扩散发展起来的一项定量技术，实质上是加速度地单向扩散。在含抗体的琼脂板一端打一排抗原孔；加入待测标本后，将抗原置阴极端，用横距2—3mA／cm的电流强度进行电泳。抗原泳向阳极，在抗原抗体比例恰当处发生结合沉淀。随着泳动抗原的减少，沉淀逐渐减少，形成峰状的沉淀区，状似火箭。抗体浓度保持不变，峰的高度与抗原量成正比，用已知量标准抗原作对照，可以方便地测定未知标本中的抗原含量。
发明内容
[0008] 本发明要解决的技术问题是克服现有技术还没有能对3个以上多糖结合疫苗成品中各的游离多糖含量进行测定的方法，导致该多糖结合疫苗成品质量难以控制的缺陷和不足，其目的是提供一种可以准确并简便、快捷地测定脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品各游离多糖含量的方法。
[0009] 为解决上述技术问题和达到本发明目的，本发明是通过以下技术方案实现的。本发明所提供的脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品各游离多糖含量的测定方法，包括以下步骤：
（1）检品供试品的制备
①预处理：取待测的4个以上的脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品用注射用水按标示量复溶，取5.0ml于超滤杯中，5000～10000×g离心超滤20～40min，收集浓缩液，补注射用水至总体积为1.0ml，得超滤浓缩液；用Lowry法测定该超滤浓缩液中蛋白的浓度；
②蛋白酶K处理：酶解反应体系总体积为420µl，以所述的酶解反应体系总体积为基准，取1/6体积的超滤浓缩液，加入1/10体积的蛋白酶K缓冲液、加入蛋白酶K，加入的蛋白酶K的量为酶解反应体系中蛋白的含量的2～8倍，并补加注射用水至420µl，混匀后于37℃孵育6小时±2小时，即得检品供试品原液JY；
③冷酚处理：另取超滤浓缩液0.6ml，按超滤浓缩液与乙酸钠饱和冷酚溶液的体积比
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