[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公布说明书
[11]公开号CN 101144059A
[43]公开日2008年3月19日
[21]申请号200710059345.4[22]申请日2007.08.29
[21]申请号200710059345.4
[71]申请人天津科技大学
地址300222天津市河西区大沽南路1038号
[72]发明人宋东辉 施定基 宋海燕 时文才 张琪 [51]Int.CI.C12N 1/12 (2006.01)
权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 2 页
[54]发明名称
[57]摘要
本发明属于生物科学和生物技术领域，涉及一
种共生蓝藻分离纯化及培养优化的方法。分离纯化
玻璃匀浆器研磨、滤液离心、沉淀重悬后，初期用
含氮BG－11(+N)培养液振荡培养，后期更换无氮BG－
11(－N)培养液振荡培养，同时在BG－11(－N)固体
培养基平板上划线分离单藻落直至纯化。培养优化
条件为：光照强度160μmol·m －2·s －1，光照周
期18h/6h，pH8.4，温度25℃，湿度90％。本发明
的优点为：共生蓝藻的分离纯化省时省力，可快速
建立共生蓝藻体外营养模式，得到非常纯净的共生
蓝藻，为进一步研究共生蓝藻的本质和共生体活性
代谢物质应用打下基础。
200710059345.4权 利 要 求 书第1/1页
1.一种共生蓝藻分离纯化及培养优化的方法，其特征在于：
共生蓝藻的分离步骤如下：共生体经表面消毒、浸泡、无菌水清洗、玻璃匀浆器研磨、
滤液离心，沉淀经含无机氮的B G-11(+N)培养液重悬后在光照培养箱中振荡培养。
共生蓝藻的纯化步骤如下：BG-11(+N)培养液培养14天后更换无氮BG-11(-N)培养液继
续振荡培养，并在BG-11(-N)固体培养基平板上划线分离，单藻落出现后连续重复划板，直
至纯化。
共生蓝藻的培养优化步骤如下：培养优化条件为：光照强度160μmol·m-2·s-1，光照周期18h/6h，pH8.4，温度25℃，湿度90％。
2.按照权利要求1所述的共生蓝藻分离纯化及培养优化的方法，其特征在于：
所述共生蓝藻包括石耳科黑石耳、红石耳、绒毛石耳以及黄山石耳等地衣共生体中的固
氮丝状体蓝藻。
200710059345.4说 明 书第1/3页
一种共生蓝藻分离纯化及培养优化的方法
技术领域
本发明涉及生物共生体的分离，具体地说是一种共生蓝藻的分离纯化以及培养优化的方法，适用于生物科学和生物技术领域中共生体的体外营养和离体培养条件的建立，有利于共生生物体内活性代谢物质的应用研究。
背景技术
共生生物与宿主之间是一种互相依存、互惠互利的协作关系，共生体代谢产生的活性物质在医疗、卫生保健以及现代生物制药中发挥越来越大的作用。作为一种内共生，单独研究共生生物在宿主体内的代谢和共生生物的生理和生化特性就显得尤其重要，但分离纯化共生生物并在体外建立培养模式非常困难。特别是共生蓝藻的分离纯化以及离体培养是进一步研究共生体的基础条件和关键环节。由于共生蓝藻特殊的营养需求难以建立体外培养模式，绝大多数共生蓝藻很难离体培养成功。
共生蓝藻的分离方法通常采用生物化学法以及物理或机械法。适用于实验室内小规模分离蓝藻共生体的生物化学法主要是酶解法，物理或机械法有挤压法、滚筒压榨法、抽吸法和匀浆法。酶解法利用不同的酶反应，分解破坏共生蓝藻与宿主细胞之间的特殊键，从而达到分离的目的。酶解法价格高，通用性差，需选择不同的酶，易引起所需蛋白质或活性物质变性。物理或机械法中的滚筒压榨法通常将共生体放在滚筒中间高速离心，在离心旋转力的作用下抛离共生蓝藻。该法易使共生蓝藻物理性状发生变化，后期培养的成功率较低。抽吸法主要通过负压接受器对共生蓝藻进行脉冲式负压抽吸达到分离目的，也会使共生蓝藻物理性状发生变化。匀浆法通过固体剪切力破碎共生体组织细胞，释放共生蓝藻进入提取液。由于匀浆过程中冲击力较小使共生蓝藻物理性状被破坏的可能性较小，所以匀浆法是实验室中简便、快速、风险小的组织破碎分离方法。
共生蓝藻长期适应宿主体液环境，体外培养要求较高，难度较大。离体的共生蓝藻需要在体外尽快建立与体内一致的营养关系，以形成完善的营养代谢机制，进行正常的生理生化反应。特别是具有固氮能力的共生蓝藻，需要在无氮源环境下才能正常生长，何时添加氮源对其生长影响很大。因此选择合适的培养基对共生蓝藻的体外培养尤其关键。目前大多数共生蓝藻很难离体培养成功的主要原因，在于不能及时建立体外培养所需的营养代谢模式。发明内容
本发明的目的是针对共生蓝藻分离纯化及体外培养技术的不足，提供一种共生蓝藻分离纯化及培养优化的方法，为进一步研究共生蓝藻的本质以及共生体活性代谢物质的应用打下基础。
为实现这一目的，本发明将玻璃匀浆器分离的共生体组织，在含无机氮的BG-11(+N)培养液中建立初步的体外营养代谢关系，再更换无氮的BG-11(-N)培养液完善其自身固氮的培养代谢机制，并改善光照强度和pH值条件，优化共生蓝藻的体外培养模式。本发明可快速建立共生蓝藻体外营养模式，缩短分离纯化共生蓝藻的时间，降低成本，提高分离纯化共生
蓝藻的成功率，能得到非常纯净的共生蓝藻，使离体培养的共生蓝藻与内共生蓝藻的物理性状保持一致。
本发明采用的技术方案为：
1.共生蓝藻分离纯化步骤如下：共生体经表面消毒、浸泡、无菌水清洗、玻璃匀浆器研磨、滤液离心，沉淀经含无机氮的BG-11(+N)培养液重悬后在光照培养箱中培养。BG-11(+N)培养液培养14天后换无氮的BG-11(-N)培养液继续培养，并在BG-11(-N)固体培养基平板上划线分离，20天后单藻落出现，连续重复划板3次，直至纯化。
2.共生蓝藻培养优化步骤如下：采用无氮的BG-11(-N)液体培养基和优化条件振荡培养共生蓝藻，每15天更换新鲜无氮BG-11(-N)液体培养基。优化培养条件为温度25℃，光照强度160μm o l·m-2·s-1，p H8.4，光照周期18h/6h，湿度90％，转速100r p m。
3.所述共生蓝藻包括石耳科黑石耳、红石耳、绒毛石耳以及黄山石耳等地衣共生体中的固氮丝状体蓝藻。
附图说明
图1为本发明实施例中浸水后野生黄山石耳内生蓝藻的显微照片(20×10)。共生状态的蓝藻细胞呈念珠状排列。具有固氮功能的异形胞位于链中部或末端，体型较营养细胞大。 图2为本发明实施例中分离纯化的黄山石耳共生蓝藻在无氮BG-11(-N)培养液中的显微照片(20×10)。分离纯化的石耳共生藻细胞形态完整，分布均匀，呈念珠状排列；营养细胞呈浅绿，无明显的细胞壁结构；异形胞清晰可见，素较浅，呈淡黄，有明显的细胞壁结构，体型较营养细胞粗大，无形态和结构损伤。镜检中未见宿主组织碎片，也无其他真菌菌丝或孢子。说明所采用的分离纯化方法得到的共生蓝藻非常纯净，物理性状也与图1中的野生态共生蓝藻保持一致。
图3为本发明实施例中分离纯化的黄山石耳共生蓝藻在无氮BG-11(-N)固体培养基平板上的单藻落照片。石耳共生蓝藻经反复分离纯化后，在BG-11(-N)固体培养基平板上形成清晰的单藻落。培养15d的藻落为圆形，边缘光滑，平均直径1.0-1.5mm；形成的单藻落素较深，呈墨绿，藻落之间无成片粘连。
具体实施方式
实施例：
1.共生蓝藻的分离步骤如下：
(1)取0.1g共生体(本例为自然干燥的野生黄山石耳)，自来水清洗后用0.1％的HgCl2表面消毒，以除去附生在石耳表面的杂菌及杂藻。无菌水浸泡1h，剪碎移入加有适量无菌水的10ml玻璃匀浆器中进行研磨匀浆；300目筛网过滤，收集上清液后5000rpm离心1min，加入3ml含无机氮的BG-11(+N)培养液重悬沉淀；所述含无机氮的BG-11(+N)培养液的组成如下：NaNO330.00g/L，K2HPO4·3H2O 0.78g/L，Na2CO3 0.20g/L，柠檬酸0.03g/L，柠檬酸铁铵0.03g/L，EDTA-Na2 0.005g/L，CaCl2·2H2O 0.18g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L，H3BO32.86g/L，MnCl2·4H2O 1.81g/L，CuSO4·5H2O 0.079g/L，Na2MoO4·2H2O 0.391 g/L，Co(NO3)2·6H2O 0.049g/L，ZnSO4·7H2O 0.222g/L，调整pH至7.4。
(2)取1ml重悬的细胞混合液移入5ml BG-11(+N)培养液的小试管里，置光照培养箱振荡培养7d后，转接至100ml三角瓶中继续振荡培养7d至培养液颜深绿，以建立初步的体外营养代谢关系。培养条件为光照120μm o l·m-2·s-1，湿度80％，温度25℃。
2.共生蓝藻的纯化步骤如下：
(1)将培养14d的深绿培养物接种到100ml无氮的BG-11(-N)培养液中继续培养，培养条件同上，以完善其体外自身固氮的营养代谢机制。此培养模式添加外加氮源反而会抑制共生蓝藻的正常生长。所述无氮BG-11(-N)培养液的组成如下：NaCl 20.6g/L，K2HPO4·3H2O 0.78g/L，Na2CO3 0.20g/L，柠檬酸0.03
g/L，柠檬酸铁铵0.03g/L，EDTA-Na2 0.005g/L，CaCl2·2H2O
0.18g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L，H3BO3 2.86g/L，MnCl2·4H2O 1.81g/L，CuSO4·5H2O 0.079g/L，Na2MoO4·2H2O 0.391g/L，Co(NO3)2·6H2O 0.049g/L，ZnSO4·7H2O 0.222g/L，调整pH至7.4。
(2)将上述培养物在BG-11(-N)固体培养基平板上划线分离，采用相同培养条件倒置光照培养，20d后平板单藻落出现，在BG-11(-N)固体培养基上重复3次平板划线分离，直至显微镜观察共生蓝藻纯化。用上述方法分离纯化的共生蓝藻其细胞形态完整，分布均匀，未见宿主组织碎片，也无其他真菌菌丝或孢子，共生蓝藻非常纯净，蓝藻细胞也无形态和结构损伤，其物理性状与野生态内共生蓝藻保持一致，如图1、图2所示。
3.共生蓝藻的优化培养步骤如下：
将分离纯化的共生蓝藻在无氮的BG-11(-N)液体培养基中振荡培养，每15天更换新鲜无氮BG-11(-N)液体培养基。优化培养条件为：调整无氮BG-11(-N)培养液pH至8.4，光照强度160μmol·m-2·s-1，光照周期18h/6h，湿度90％，温度25℃，转速100rpm。此优化培养条件对共生蓝藻的生长有很强促进作用，共生蓝藻生长非常旺盛。如图2所示，按照这样的培养条件，共生蓝藻经过一年的继代培养仍然能保持旺盛的生长能力，其理化性状仍与野生态共生蓝藻保持一致。这为进一步研究共生蓝藻的本质以及共生体活性代谢物质的应用打下坚实的基础。
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