(10)申请公布号 (43)申请公布日 2010.08.25*CN101812536A*
(21)申请号 200910024428.9
(22)申请日 2009.02.24
C12Q 1/70(2006.01)
C12Q 1/68(2006.01)
C12N 15/11(2006.01)
C12R 1/93(2006.01)
(71)申请人江苏默乐生物科技有限公司
地址225300 江苏省泰州市药城大道1号
R19楼
(72)发明人杨英 符芳芳 李杨霞
(74)专利代理机构泰州地益专利事务所 32108
代理人王楚云
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了用于实时荧光定量PCR 检测丙
型肝炎病毒荧光定量检测的引物和探针。这些引
物探针具有高特异性和高扩增效率的特点，因此
本发明大大提高了HCV RNA 检测的灵敏度和特异
性。其设计方法包括：用比对软件对GenBank 的所
有HCV 完整基因组进行比对，并鉴别几个主要的
保守区域，再进一步用blast 筛选并设计多条引
物探针。(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书 1 页 说明书 5 页CN 101812536 A
C N 101812536 A
1.一种检测生物标本中HCV RNA存在的引物和探针，其中检测到所述的扩增产物表明所述标本中存在HCV RNA。
2.一种如权利要求1所述的方法，其中所述的逆转录反应采用一种或多种具有相应于HCVRNA序列的寡核苷酸引物进行。 3.一种如权利要求1所述的方法，其中所述的寡核苷酸引物选自以下序列：5’UTR：
1F 5’ATCACTCC CCTGTGAGGA AC3’
1R 5’GGCAATTCCGGTGTACTCAC3’
2F 5’CCATGGCGTTAGTATGAGTG3’
2R 5’CAGTACCACAAGGCCTTTCG3’
其中用1-F和1-R扩增的序列长度是145bp，用2-F和2-R扩增的序列长度是210bp。
4.一种如权利要求1所述的方法，其中所述的检测用一条或多条探针发出的荧光强度来定量检测扩增产物，其中所述的探针选自以下序列5’UTR：
1Pb 1：5’CCATGGCGTTAGTATGAGTG 3’
1Pb2：5’CCCTCCCGGGAGAGCCATA GTG 3’
2Pb1：5’CCC CCCTCCCGGGAGAGCC 3’
2Pb2：5’CCG GTGA GTACACCGGA ATTGCC 3’
1-Pb1\1-Pb2和2-Pb1\2-Pb2分别检测1-F和1-R扩增的序列和2-F和2-R扩增的序列。
5.一种如权利要求1所述的方法，其中所述的寡核苷酸引物选自以下序列3’NCR：
3F 5’TGGCTCCA TCTTAGCCCT AG 3’
3R 5’ACATGATCTGCAGAGAGG 3’
扩增的序列长度是98bp。
6.一种如权利要求1所述的方法，其中所述的检测用一条或多条探针发出的荧光强度来定
量检测扩增产物，一种如权利要求5限定，其中所述的探针选自以下序列3’NCR：3Pb15’GCCCT AGTCACGGCT AGCTGTG 3’
3Pb25’GGTCCGTGAG CCGCATGACT GC 3’。
7.一种如权利要求1所述的方法，其中所述生物标本选自血液、血清、血浆、尿、唾液和脑脊液。
8.一种如权利要求1所述的方法，其中包含一对5’UTR寡核苷酸引物和一条或多条5’UTR探针，一对3’NCR寡核苷酸引物和一条或多条3’NCR探针，或是两套探针引物的组合物，引物探针序列组合如下：
1F/1R/1Pb1，1F/1R/1Pb2，1F/1R/1Pb1和1Pb2，2F/2R/2Pb1，2F/2R/2Pb2，2F/2R/2Pb1和2Pb2，3
F/3R/3Pb1，3F/3R/3Pb2，3F/3R/3Pb1和3Pb2。
丙型肝炎病毒荧光定量检测的引物和探针
技术领域：
[0001] 本发明涉及检测丙型肝炎病毒核糖核酸的高特异性和高扩增效率的多条引物和探针。
背景技术：
[0002] 丙型肝炎病毒(HCV)是一种不经过肠胃传染的引起输血后肝炎疾病的病毒，据估计全球1％以上人口感染了HCV，急慢性肝炎、肝硬变和肝细胞癌都与HCV感染相关。目前HCV归为黄病毒科中的一个独立的属，其基因组的特点是约9500bp的单正链RNA分子，含有一个编码约3000个氨基酸组成的蛋白前体ORF，在该ORF之前有约HCV基因组中最保守的340bp 5’UTR，ORF5’区域编码一个衣壳蛋白、两种包膜糖蛋白(E1和E2)以及一种未知功能的小蛋白(P7)，ORF 3’区域编码包括一种蛋白酶、蛋白酶/解旋酶双功能蛋白、RNA聚合酶和调节肽等非结构蛋白，ORF 3’区域也包含一个3’NCR。
[0003] 不同HCV病毒分离株间有显著的序列差异，多种基因型给诊断检测带来难度。而且，HCV感染患者的病毒载量较低，所以需要设计高特异性和高灵敏度的引物和探针提高HCV的检出率。
发明内容：
[0004] 本发明的目的在于提供能有效提高检测灵敏度和特异性的引物探针及其组合物。在GenBank release 168.0中，用改进型的ClustalW对所有完整基因组进行了比对，对多项比对的结果进行了比较，鉴别了几个主要的保守区域，用这些保守区域对GenBank序列进行blast筛选，发现这些区域的保守性非常高。
[0005] 几个保守序列如下：
[0006] 5’UTR (3-70)ATCACTCC CCTGTGAGGA ACTACTGTCT TCACGCAGAAAGCGTCTAGC CATGGCGTTA GTATGAGTGT
[0007] 5’UTR(87-145)CCCC CCCTCCCGGG AGAGCCATA GTGGTCTGCG GAACCGGTGA GTACACCGGA ATTGCC
[0008] 5’UTR(238-306)GC GAAAGGCCTT GTGGTACTGC CTGATAGGGT GCTTGCGAGTGCCCCGGGA GGTCTCGTAG ACCGTGCA
[0009] 3’NCR(9549-9646)GGTGGCTCCA TCTTAGCCCT AGTCACGGCT AGCTGTGAAAGGTCCGTGAG CCGCATGACT GCAGAGAGTG CTGATACTGG CCTCTCTGCAGATCATGT
[0010] 对5’UTR保守区域序列设计多对引物和探针及其组合物1F/11R1Pb1，1F/1R/1Pb2，1F/1R/1Pb1和1Pb2，2F/2R/2Pb1，2F/2R/2Pb2，2F/2R/2Pb1和2Pb2，对3’NCR 保守区域序列设计多对引物和探针及其组合物3F/3R/3Pb1，3F/3R/3Pb2，3F/3R/3Pb1和3Pb2。对5’UTR保守区域序列和3’NCR保守区域序列设计的探针引物组合物有1F/1R/1Pb1和1Pb2与3F/3R/3Pb 1和3Pb2，2F/2R/2Pb 1和2Pb2与3F/3R/3Pb 1和3Pb2。。[0011] 每套引物和探针组合序列如下：
[0012] 1F/1R/1Pb1：
[0013] 1F 5’ATCACTCC CCTGTGAGGA AC3’[0014] 1R 5’GGCAATTCCGGTGTACTCAC3’[0015] 1Pb 15’CCATGGCGTTAGTATGAGTG 3’[0016] 1F/1R/1Pb2：
[0017] 1F 5’ATCACTCC CCTGTGAGGA AC3’[0018] 1R 5’GGCAATTCCGGTGTACTCAC3’[0019] 1Pb25’CCCTCCCGGGAGAGCCATA GTG 3’[0020] 1F/1R/1Pb1和1Pb2：
[0021] 1F 5’ATCACTCC CCTGTGAGGA AC3’[0022] 1R 5’GGCAATTCCGGTGTACTCAC3’[0023] 1Pb 15’CCATGGCGTTAGTATGAGTG 3’[0024] 1Pb25’CCCTCCCGGGAGAGCCATA GTG 3’[0025] 2F/2R/2Pb1：
[0026] 2F 5’CCATGGCGTTAGTATGAGTG3’[0027] 2R 5’CAGTACCACAAGGCCTTTCG3’[0028] 2Pb15’CCC CCCTCCCGGGAGAGCC 3’[0029] 2F/2R/2Pb2：
[0030] 2F 5’CCATGGCGTTAGTATGAGTG3’[0031] 2R 5’CAGTACCACAAGGCCTTTCG3’[0032] 2Pb25’CCG GTGA GTACACCGGA ATTGCC 3’[0033] 2F/2R/2Pb 1和2Pb2：
[0034] 2F 5’CCATGGCGTTAGTATGAGTG3’[0035] 2R 5’CAGTACCACAAGGCCTTTCG3’[0036] 2Pb15’CCC CCCTCCCGGGAGAGCC 3’[0037] 2Pb25’CCG GTGA GTACACCGGA ATTGCC 3’[0038] 3F/3R/3Pb 1：
[0039] 3F 5’TGGCTCCA TCTTAGCCCT AG 3’[0040] 3R 5’ACATGATCTGCAGAGAGG 3’[0041] 3Pb 1GCCCT AGTCACGGCT AGCTGTG [0042] 3F/3R/3Pb2：
[0043] 3F 5’TGGCTCCA TCTTAGCCCT AG 3’[0044] 3R 5’ACATGATCTGCAGAGAGG 3’[0045] 3Pb2GGTCCGTGAG CCGCATGACT GC [0046] 3F/3R/3Pb1和3Pb2：
[0047] 3F 5’TGGCTCCA TCTTAGCCCT AG 3’[0048] 3R 5’ACATGATCTGCAGAGAGG 3’[0049] 3Pb 1GCCCT AGTCACGGCT AGCTGTG [0050] 3Pb2GGTCCGTGAG CCGCATGACT GC
[0051] 这里的“引物”是一个长度约为9-60bp的寡聚核苷酸，优选长度约为15-30bp的寡聚核苷酸，最佳长度约为18-22bp的寡聚核苷酸。
[0052] 任何组合的一套引物探针都可用于荧光定量检测，优选的用于扩增HCV基因组的引物探针包括：
[0053] (a)
[0054] 1F/1R/1Pb1和1Pb2：
[0055] 1F 5’ATCACTCC CCTGTGAGGA AC3’
[0056] 1R 5’GGCAATTCCGGTGTACTCAC3’
[0057] 1Pb 15’CCA TGGCGTTAGTATGAGTG 3’
[0058] 1Pb25’CCCTCCCGGGAGAGCCATA GTG 3’
[0059] 3F/3R/3Pb1和3Pb2
[0060] 3F 5’TGGCTCCA TCTTAGCCCT AG 3’
[0061] 3R 5’ACATGATCTGCAGAGAGG 3’
[0062] 3Pb15’GCCCTAGTCACGGCTAGCTGTG3’
[0063] 3Pb25’GGTCCGTGAG CCGCATGACT GC3’
[0064] (b)
[0065] 2F/2R/2Pb 1和2Pb2：
[0066] 2F 5’CCATGGCGTTAGTATGAGTG3’
[0067] 2R 5’CAGTACCACAAGGCCTTTCG3’
[0068] 2Pb15’CCC CCCTCCCGGGAGAGCC 3’
[0069] 2Pb25’CCG GTGA GTACACCGGA ATTG CC 3’
[0070] 3F/3R/3Pb1和3Pb2
[0071] 3F 5’TGGCTCCA TCTTAGCCCT AG 3’
[0072] 3R 5’ACATGATCTGCAGAGAGG 3’
[0073] 3Pb 15’GCCCT AGTCACGGCT AGCTGTG 3’
[0074] 3Pb25’GGTCCGTGAG CCGCATGACT GC 3’
[0075] 在一个优选实例中，优选的引物探针包括1F/1R/1Pb1和1Pb2，3F/3R/3Pb1和3Pb2。在另一个优选实例中，优选的引物探针包括2F/2R/2Pb1和2Pb2，3F/3R/3Pb1和3Pb2。
具体实施方式
[0076] 实施例子：用HCV基因组的5’UTR和3’NCR引物和探针检测生物标本中HCV。[0077] A.方法
[0078] 1.标本制备
[0079] 用常用的商业试剂盒抽提标本RNA。
[0080] 2.一步法核酸扩增反应
[0081] 在20μl体系里进行一步法核酸扩增反应，反应溶液组成是：30mM Tris-HCl(pH8.0)，65mM KCl，3mM MgCl
，30mM DTT，0.4mM各种dNTP，20Units RNasin，
2
3.72mM NaCl，0.5μM探针和1.0μM引物，加入100U重组莫罗尼鼠类白血病病毒(M-MLV)逆转录酶(RT)，
16U HotStart Taq酶，42℃反应30min后，再用94℃反应3min灭活逆转录
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议