(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010779216.8
(22)申请日 2020.08.05
(71)申请人 清华大学
地址 100084 北京市海淀区清华园
(72)发明人 任大海 勾易行 刘佳文 尤政
(74)专利代理机构 北京众合诚成知识产权代理
有限公司 11246
代理人 陈波
(51)Int.Cl.
C12N 5/09(2010.01)
(54)发明名称
备方法
(57)摘要
本发明公开了属于生物医学工程技术领域
方法。所述磁珠以Fe 3O 4磁珠为核，以Au为壳；在
所述Au壳表面修饰硫基单分子层，并活化所述硫
基单分子之上的羧基。本发明的磁珠具有良好的
分散性、生物相容性和稳定性，且具有较低的生
理毒性，可以和多种抗体绑定，和细胞结合后，具
有高效的分离和捕获效果。权利要求书1页 说明书5页 附图3页CN 111893095 A 2020.11.06
C N 111893095
A
1.一种用于循环肿瘤细胞捕获的磁珠，其特征在于，所述磁珠以Fe 3O 4磁珠为核，以Au为壳；在所述Au壳表面修饰硫基单分子层，并活化所述硫基单分子之上的羧基。
2.根据权利要求1所述的磁珠，其特征在于，所述硫基单分子层包括6-硫基-1-己醇和11-巯基十一烷酸共同修饰。
3.根据权利要求1或2所述的磁珠，其特征在于，所述Fe 3O 4磁珠的内核直径为60-100nm，所述Au壳的厚度为20～30nm；所述Fe 3O 4磁珠为修饰后的Fe 3O 4磁珠，所述修饰为硅烷化。
4.一种用于循环肿瘤细胞捕获的磁珠的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将Fe 3O 4磁珠加入适量乙醇溶液中，搅拌后静置得Fe 3O 4磁珠溶液；
(2)将上述制备的Fe 3O 4磁珠溶液、胶体金溶于乙醇溶液，于室温下搅拌；将生成物磁分离，收集固体产物，得到Fe 3O 4-Au磁珠；
(3)将6-硫基-1-己醇和11-巯基十一烷酸溶于无水乙醇后，加入Fe 3O 4-Au磁珠，震荡，静置；将生成物磁分离，收集固体产物，得到修饰后的Fe 3O 4-Au磁珠；
(4)将N -羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶于去离子水中，加入修饰后的Fe 3O 4-Au磁珠，振荡，静置；将生成物磁分离，收集固体产物，得到用于循环肿瘤细胞捕获的磁珠。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述Fe 3O 4磁珠为修饰后的Fe 3O 4磁珠，所述修饰为硅烷化或氨基化；所述Fe 3O 4磁珠直径为60-100nm，所述胶体金颗粒直径为20nm -30nm。
6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述乙醇溶液为浓度为50％-70％的乙醇溶液。
7.根据权利要求4-6任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述乙醇溶液中胶体金加入的量为0.5-1.5g/L，Fe 3O 4磁珠加入量为2-7g/L。
8.根据权利要求4-7任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述6-硫基-1-己醇和11-巯基十一烷酸的质量比例为0.8～1.4：1，所述Fe 3O 4-Au磁珠加入量为2-7g/L，所述Fe 3O 4-Au磁珠和MCH的质量比为1-3：1。
9.根据权利要求4-8任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述N -羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐质量比为0.5～1.5：1；
所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和修饰后的Fe 3O 4-Au磁珠质量比为2-5：1，所述修饰后的Fe 3O 4-Au磁珠以5-10g/L的比例溶于去离子水中。
10.权利要求1-3任一项所述磁珠的以下应用：
(1)在制备用于循环肿瘤细胞捕获产品中的应用；(2)在循环肿瘤细胞捕获中的应用。
权 利 要 求 书1/1页CN 111893095 A
一种用于循环肿瘤细胞捕获的磁珠及其制备方法
技术领域
[0001]本发明属于生物医学工程技术领域，具体涉及一种用于循环肿瘤细胞捕获的磁珠及其制备方法。
背景技术
[0002]循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTC)是指从实体瘤原发灶或转移灶脱离，经历上皮间质转化而入侵外周血中的各类肿瘤细胞。CTC扩散在循环系统中，并可能通过黏附形成新的癌症转移灶。根据最新的统计报告(陈万青，孙可欣，郑荣寿，等.2014年中国分地区恶性肿瘤发病和死亡分析[J].中国肿瘤,2018(1))，恶性肿瘤已经成为我国国民死亡的主要原因。对于CTC的检测可用于癌症的早期诊断以及监测肿瘤转移，以及癌症预后评估。CTC在外周血中数量极少，平均每106-107个血细胞中才能检测到一个，故对于CTC的分选富集是对其进行检测的前提。
[0003]目前循环肿瘤细胞的检测方法主要分为物理学方法和生物化学方法。(i)物理形态分离法：主要有滤膜法和确定性侧向位移法，这些技术都是基于CTCs与血细胞不同的物理性质，例如大小、变形性、介电性等将CTCs与血细胞分离。(ii)生物化学方法：其中最有代表性的是免疫磁珠分选和流式细胞术，
这些技术大多基于细胞表面蛋白表达实现分离。基于免疫磁珠检测方法的Cellsearch系统是目前唯一通过美国食品药品监督管理局(FDA)认证的循环肿瘤细胞检测平台，其是通过构建抗EpCAM免疫磁珠与CTCs上皮细胞黏附因子特异性结合，实现对于CTC的鉴定。另外，Hoshino等人使用抗EpCAM抗体绑定的磁珠捕获循环肿瘤细胞并在外加磁场的微流控芯片中进行分选，效率达到86％～90％(Hoshino K,et al.Microchip-based Immunomagnetic Detection of Circulating Tumor Cell[J].Lab on a Chip,2011,11(20):3449-3457.)。但目前的方法利用磁珠直接绑定CTC，会对细胞本身生物化学特性造成一定影响，不利于后续细胞的检测。
发明内容
[0004]为解决现有技术中存在的可能破坏细胞生物特性的问题，提供一种在对生物细胞低损伤的条件下，实现循环肿瘤细胞高效捕获的磁珠。
[0005]一种用于循环肿瘤细胞捕获的磁珠，所述磁珠以Fe3O4磁珠为核，以Au为壳；在所述Au壳表面修饰硫基单分子层，并活化所述硫基单分子之上的羧基。
[0006]上述磁珠中，所述硫基单分子层包括6-硫基-1-己醇和11-巯基十一烷酸共同修饰。
[0007]上述磁珠中，所述Fe3O4磁珠的内核直径为60-100nm，例如：60nm、70nm、80nm、90nm 或100nm；
[0008]所述Au壳的厚度为20～30nm，例如：20nm、25nm或30nm。
[0009]上述磁珠中，所述Fe3O4磁珠为修饰后的Fe3O4磁珠，所述修饰为硅烷化或氨基化。[0010]本发明的另一目的在于提供一种用于循环肿瘤细胞捕获的磁珠的制备方法，所述
制备方法，包括以下步骤：
[0011](1)将Fe3O4磁珠加入适量乙醇溶液中，搅拌后静置得Fe3O4磁珠溶液；
[0012](2)将上述制备的Fe3O4磁珠溶液、胶体金溶于乙醇溶液，于室温下搅拌；将生成物磁分离，收集固体产物，得到Fe3O4-Au磁珠；
[0013](3)将6-硫基-1-己醇和11-巯基十一烷酸溶于无水乙醇后，加入Fe3O4-Au磁珠，震荡，静置；将生成物磁分离，收集固体产物，得到修饰后的Fe3O4-Au磁珠；
[0014](4)将N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶于去离子水中，加入修饰后的Fe3O4-Au磁珠，振荡，静置；将生成物磁分离，收集固体产物，得到用于循环肿瘤细胞捕获的磁珠。
[0015]上述方法中，所述Fe3O4磁珠为修饰后的Fe3O4磁珠，所述修饰为硅烷化；所述Fe3O4磁珠直径
为60-100nm，例如：60nm、70nm、80nm、90nm或100nm；例如，硅烷化Fe3O4磁珠，制备方法为常规方法，其修饰物可以是3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTMS)，3-巯基丙基三甲氧基硅烷(MPTMS)。
[0016]所述胶体金颗粒直径为20nm-30nm，例如：20nm、25nm或30nm。
[0017]上述方法中，所述乙醇溶液为浓度为50％-70％的乙醇溶液。
[0018]上述方法中，步骤(2)中，所述乙醇溶液中胶体金加入的量为0.5-1.5g/L，Fe3O4磁珠加入量为2-10g/L，例如，5-7g/L。
[0019]上述方法中，步骤(3)中，所述6-硫基-1-己醇和11-巯基十一烷酸的质量比例为0.8～1.4：1，例如，0.8:1、1：1或1.2：1；
[0020]所述Fe3O4-Au磁珠加入量为5-10g/L，例如，5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L或10g/L；[0021]所述Fe3O4-Au磁珠和MCH的质量比为1-3：1，例如，2：1或3：1。
[0022]上述方法中，步骤(4)中，所述N-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐质量比为0.5-1.5：1；例如，0.7-1.2：1、0.8-1.1：1或0.9-1.0：1；
[0023]所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和修饰后的Fe3O4-Au磁珠质量比为2-10：1，例如，2-7:1或2-5:1。
[0024]所述修饰后的Fe3O4-Au磁珠以5-10g/L的比例溶于去离子水中，例如，5-7g/L。[0025]上述方法中，所述胶体金可以通过还原法制备。例如，制备方法可以包括：[0026]将四氯合金酸、去离子水、柠檬酸三钠溶于去离子水中，机械搅拌2分钟得到胶体金前置溶液。将硼氢化钠溶于柠檬酸三钠溶液中，加入胶体金前置溶液，玻璃棒快速搅拌5分钟得到胶体金。
[0027]本发明的另一目的旨在提供上述用于循环肿瘤细胞捕获的磁珠的制备方法制备的捕获磁珠。
[0028]本发明的第三个目的在于，提供上述磁珠的以下应用：
[0029](1)在制备用于循环肿瘤细胞捕获产品中的应用；
[0030](2)在循环肿瘤细胞捕获中的应用。
[0031]例如，将上述制备的用于循环肿瘤细胞捕获的磁珠和抗体结合制备免疫磁珠，用于循环肿瘤细胞捕获，结合方法可以包括：
[0032]将上述制备的用于循环肿瘤细胞捕获的磁珠、抗体和PBS缓冲液混合，在室温下缓慢振荡一小时，将生成物离心分层，收集固体产物，用PBS缓冲液洗涤后得到免疫磁珠；例
如，所述抗体为抗EpCAM抗体，可以为其他可以用于循环肿瘤细胞捕获的抗体。
[0033]与现有技术相比，本发明具有如下优点：
[0034]本发明的磁珠以直径80-100m的修饰后的Fe3O4为内核，其具有超顺磁性、低剩磁的优点，使制备的磁珠分散程度高，不易粘连；以金为壳，金的生物化学特性使磁珠具有良好的生物相容性和稳定性和较低的生理毒性，因而能减小对细胞的损伤，使得分选之后的细胞依然具有良好的生物活性，便于检测。进一步的，本发明的磁珠通过活化羧基的硫基分子与抗体相连，能与多种抗体绑定，保证了检测应用的灵活性，和细胞结合后，具有高效的分离和捕获效果。
附图说明
[0035]图1为本发明用于循环肿瘤细胞捕获的核壳结构磁珠制备流程图。
[0036]图2为本发明免疫修饰核壳磁珠流程图。
[0037]图3为本发明制备的免疫磁珠表面zeta电位图。
[0038]图4为本发明用以测试生物相容性所做的细胞实验。
[0039]图5为本发明制备的免疫磁珠与CTCs绑定的共聚焦显微图。
[0040]图6为绑定磁珠的细胞在流道中的在磁场有无的情况下的迁移情况，流道出口分为两个：上部为分选流道，下部为默认流道；上图为无磁场的情况，其中绑定磁珠的细胞均流向默认流道，下图为有磁场的情况，绑定磁珠的细胞在磁场的作用下被磁珠牵引向分选流道迁移，体现磁珠对细胞的富集效应。
具体实施方式
[0041]下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明中所使用的材料和装置，如无特殊说明，均为市售。
[0042]以下结合说明书附图和实施例对本发明作进一步的说明，但不是限制本发明。[0043]实施例1磁珠的制备
[0044]根据图1和图2所示流程，制备本发明的磁珠。
[0045]硅烷化Fe3O4磁珠，制备方法为常规方法，其修饰物可以是3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTMS)，3-巯基丙基三甲氧基硅烷(MPTMS)。
[0046]胶体金通过氧化还原法制备，其制备方法可以为：
[0047]将四氯合金酸、去离子水、柠檬酸三钠溶于去离子水中，机械搅拌2分钟得到胶体金前置溶液。将硼氢化钠溶于柠檬酸三钠溶液中，加入胶体金前置溶液，玻璃棒快速搅拌5分钟得到胶体金，制备的胶体金颗粒直径为20nm-30nm。
[0048]磁珠的制备方法，包括如下：
[0049] 1.制备核壳结构磁珠：
[0050](11)取直径为80nm的硅烷化Fe3O4磁珠，加入适量的50％乙醇溶液，用玻璃棒快速搅拌约10分钟，静置得Fe3O4磁珠溶液；
[0051](12)将Fe3O4磁珠溶液和胶体金溶于70％乙醇溶液，于室温下剧烈的机械搅拌过
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