(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810987193.2
(22)申请日 2018.08.28
(71)申请人 青岛科技大学
地址 266000 山东省青岛市市北区郑州路
53号
(72)发明人 张永勤 张凤国 王鹏博 许文廷
邢明霞 吕兴霜 张坤
(74)专利代理机构 青岛中天汇智知识产权代理
有限公司 37241
代理人 郝团代
(51)Int.Cl.
G01N 24/08(2006.01)
(54)发明名称一种测定羟丙基壳聚糖N -取代度、总取代度和乙酰化度的方法(57)摘要本发明公开一种测定羟丙基壳聚糖N -取代度、总取代度和乙酰化度的方法，具体包括以下步骤：样品制备：a.干燥羟丙基壳聚糖样品；b.向干燥好的羟丙基壳聚糖样品中加入氘代试剂，直至将其完全溶解；样品测试：通过核磁共振仪获得羟丙基壳聚糖的核磁共振图谱；数据处理：从得到的核磁共振谱图中，首先进行波谱归属，然后进行各质子峰的面积积分与计算；得到羟丙基壳聚糖N -取代度、总取代度和乙酰化度的计算公式。本申请能检测出两个独立的H 9-N 质子峰和H 9-O 质子峰，通过H 9-N 质子峰可探知羟丙基壳聚糖分子中发生氨基的羟丙基化的糖单元的比例。相对于现有技术中的取代度的测定方法，本发明归属更为明确、细致，测定更为准确、多指标高效、简便、 快速。权利要求书2页 说明书9页 附图3页CN 109211957 A 2019.01.15
C N 109211957
A
1.一种测定羟丙基壳聚糖N-取代度的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)样品制备
a.干燥羟丙基壳聚糖样品，将其水分控制在4％以下；
b.向干燥好的羟丙基壳聚糖样品中加入氘代试剂，直至将其完全溶解；
(2)样品测试
将步骤(1)中制备的样品置于核磁共振仪中，获得羟丙基壳聚糖的核磁共振图谱；
(3)数据处理
从(2)步骤得到的核磁共振谱图中，首先进行波谱归属，然后进行各质子峰的面积积分与计算；
波谱归属为1.22ppm左右的质子峰为与氨基相连的羟丙基上的甲基质子峰，其积分为H9-N；波谱归属为4.9ppm左右的质子峰为氨基未被取代的糖单元上的异头碳质子峰，其积分为H1-D；波谱归属为2.05ppm左右的质子峰为与氨基相连的乙酰基上的甲基质子峰，其积分为H Ac，则N-取代度的计算公式如下：
2.根据权利要求1所述的一种测定羟丙基壳聚糖N-取代度的方法，其特征在于，所述步骤(3)的数据处理中，波谱归属为5.0ppm左右的质子峰为氨基被羟丙基取代的糖单元上的异头碳质子峰，其积分为H1-S；
波谱归属为4.6ppm左右的质子峰为氨基被乙酰化了的糖单元上的异头碳质子峰，其积分为H1-Ac；H Ac/3等同替换为H1-Ac，H1-S等同替换为H9-N/3，则N-取代度的计算公式如下：
3.根据权利要求1所述的一种测定羟丙基壳聚糖N-取代度的方法，其特征在于，用于测定羟丙基壳聚糖总取代度的方法，所述步骤(3)中波谱归属为1.22ppm左右的质子峰为与氨基相连的羟丙基上的甲基质子峰，其积分为H9-N；波谱归属为1.11ppm左右的质子峰为与C6位和C3位羟基相连的羟丙基上的甲基质子峰，其积分为H9-O，H9-N和H9-O这两个甲基质子峰的总积分为H9；则总取代度的计算公式如下：
4.根据权利要求3所述的一种测定羟丙基壳聚糖N-取代度的方法，其特征在于，用于测定羟丙基壳聚糖总取代度的方法，所述步骤(3)的数据处理中，波谱归属为
5.0ppm左右的质子峰为氨基被羟丙基取代的糖单元上的异头碳质子峰，其积分为H1-S；波谱归属为4.6ppm左右的质子峰为氨基被乙酰化了的糖单元上的异头碳质子峰，其积分为H1-Ac；H Ac/3等同替换为H1-Ac，H1-S等同替换为H9-N/3，则总取代度的计算公式如下：
5.根据权利要求1所述的一种测定羟丙基壳聚糖N-取代度的方法，其特征在于，用于测定羟丙基壳聚糖的乙酰化度DA的方法，则乙酰化度DA的计算公式如下：
6.根据权利要求1-5任一所述的一种测定羟丙基壳聚糖N-取代度的方法，其特征在于，所述的羟丙基壳聚糖的结构式如下：
其中，与氨基相连的羟丙基基团上的羟基为仲羟基，与羟基相连的羟丙基基团上的羟基为伯羟基。
7.根据权利要求1-5任一所述的一种测定羟丙基壳聚糖N-取代度的方法，其特征在于，所述的步骤(1)样品制备中羟丙基壳聚糖样品在80℃干燥4-5小时，迅速升温至105℃再干燥1-2小时，干燥至恒重。
8.根据权利要求1-5任一所述的一种测定羟丙基壳聚糖N-取代度的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中氘代试剂为D2O和DCl按照体积比为50：(1-50)混合而成的溶液。
9.根据权利要求1-5任一所述的一种测定羟丙基壳聚糖N-取代度的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中核磁共振仪的参数设置如下：设置温度为60-70℃，采集数据前的热平衡时间为10-20分钟。
一种测定羟丙基壳聚糖N-取代度、总取代度和乙酰化度的
方法
技术领域
[0001]本发明属于羟丙基壳聚糖的研究及应用领域，涉及一种测定羟丙基壳聚糖取代度的方法，具体涉及一种核磁共振氢谱法测定羟丙基壳聚糖N-取代度、总取代度和乙酰化度的方法。
背景技术
[0002]壳聚糖具有良好的生物相容性、生物可降解性、稳定性、安全性，但其水溶性较差，只能溶于酸性介质，而将壳聚糖羟丙基化生成羟丙基壳聚糖(HPCTS)，则可改善其溶解性，从而大大拓宽其应用领域与开发进程。经研究表明，羟丙基壳聚糖具有溶解性、吸湿性、保湿性、成膜性、起泡性、清除自由基、抗菌性、吸附性，在医药、化妆品、食品、造纸、纺织等领域均有广泛应用前景。近年来，以羟丙基壳聚糖为原料再合成其它衍生物的研究与应用工作也如火如荼地开展起来。
[0003]当发现羟丙基壳聚糖具有如此潜在的应用价值，相关研究人员必然会进一步研究羟丙基在壳聚糖上的取代度(羟丙基壳聚糖分子中每个氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖单元上连接的羟丙基的数量)对羟丙基壳聚糖性能及其应用的影响，因为，并非取代度越高，羟丙基壳聚糖的性能越优越，而且，应用领域不同，对取代度的要求也不同。然而，有关这方面的研究却鲜见报道，究其原因，目前现有的检测方法存在诸多问题。
[0004]氧化联合滴定法刊载于《中国药典》二部，如发表在《中国海洋药物》上的“不同取代度的羟丙基壳聚糖生物降解性研究”(2004,1:33-36)，但该法操作繁琐、耗时且数据重现性较差，而且，该文也并未公开相关检测数据。
[0005]元素分析法是国内外文献中比较推崇的方法，如Peng等人的文章“Preparation and antimicrobial activity of hydroxypropyl chitosan,Carbohydrate Research, 2005,340:1846–1851”和Dong等人的文章“Inf l ue nce of d eg ree of m ola r etherification on critical liquid crystal behavior of hydroxypropyl chitosan.European Polymer Journal,2001,37(8):1713–1720”，该法用量少、无需溶解样品、测量准确可靠，因而常被作为标准方法用于与其它方法的比较研究。然而，该法只适用于测定已知脱乙酰度的HPCTS样品，且无法探知羟丙氧基的具体取代位置，更为重要的是，无法探知糖单元上氨基的被取代(即，N-取代)状态。然而，迄今为止，羟丙基壳聚糖的N-取代度的测定方法未见相关报道。
[0006]核磁共振氢谱法可用于波谱解析物质的化学结构，以推测化学反应机理而备受本领域技术人员青睐。此外，因其操作简便、用量少、不破坏样品、可确定H在化学结构中的位置和数量而广为使用。目前公开的相关方法主要为董炎明提出的1H-NMR法(Dong Y,et al.Influence of degree of molar etherification on critical liquid crystal behavior of hydroxypropyl chitosan.European Polymer Journal,2001，37(8)：1713–1720)。其具体测试方法为，以D2O或者CF3COOH/D2O为溶剂，在常温或25℃条件下测试。江志
强等人以D2O/DCl为溶剂在50℃条件下测试(江志强，王征科，张柯等.温敏性羟丙基壳聚糖的制备及其性能.材料科学与工程学报，2013，31(5):687-696)，并将董炎明的取代度的计算公式化简并整合为DS＝(H9/3)/((H2-8-H9)/6)。然而，由该公式所得取代度往往与元素分析法的结果相差较大，如上述Peng的文章中元素分析法所测数值为2.54(该文1849页左栏倒数第3行)，而用该公式所得取代度为2.8(参见该文1849页左栏倒数第3行)。究其原因，羟丙基壳聚糖属于高分子聚合物，其分子量一般在几十万左右，甚至更高。与一般的小分子不同点在于，羟丙基壳聚糖结构中存在多种分子内、分子间的相互作用，因而，用不同化学位移处质子峰积分来定量计算对应环境下的质子数量很容易引入误差；另一方面，由于测试条件不够优化，致使特征峰重叠在一起而无法以单峰计量，导致该分母中的H2-8积分测量值偏小，从而显著增大了取代度的测量值，更为重要的是，无法探知N-取代的存在。迄今为止，有关氨基被羟丙基化的程度(即N-取代度，羟丙基壳聚糖分子中每个糖单元发生N-羟丙基化的平均数量)从未见公开过。
[0007]鉴于此，探寻N-取代度和更为优化的总取代度1H NMR测定方法势在必行。
发明内容
[0008]为了解决上述现有技术的不足，本发明首要目的在于提供一种简便快速、准确的测定羟丙基壳聚糖N-取代度、总取代度和乙酰化度的方法。
[0009]本发明的目的通过以下技术方案来实现：
[0010]一种测定羟丙基壳聚糖N-取代度的方法，具体包括以下步骤：
[0011](1)样品制备
[0012] a.干燥羟丙基壳聚糖样品，将其水分控制在4％以下；
[0013] b.向干燥好的羟丙基壳聚糖样品中加入氘代试剂，直至将其完全溶解；
[0014](2)样品测试
[0015]将步骤(1)中制备的样品置于核磁共振仪中，获得羟丙基壳聚糖的核磁共振图谱；[0016](3)数据处理
[0017]从(2)步骤得到的核磁共振谱图中，首先进行波谱归属，然后进行各质子峰的面积积分与计算；
[0018]波谱归属为1.22ppm左右的质子峰为与氨基相连的羟丙基上的甲基质子峰，其积分为H9-N；波谱归属为4.9ppm左右的质子峰为氨基未被取代的糖单元上的异头碳质子峰，其积分为H1-D；波谱归属为2.05ppm左右的质子峰为与氨基相连的乙酰基上的甲基质子峰，其积分为H Ac，则N-取代度的计算公式如下：
[0019]
[0020]进一步的，所述步骤(3)的数据处理中，波谱归属为5.0ppm左右的质子峰为氨基被羟丙基取代的糖单元上的异头碳质子峰，其积分为H1-S；波谱归属为4.6ppm左右的质子峰为氨基被乙酰化了的糖单元上的异头碳质子峰，其积分为H1-Ac；H Ac/3等同替换为H1-Ac，H1-S等同替换为H9-N/3，则N-取代度的计算公式如下：
[0021]
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