(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710841373.5
(22)申请日 2017.09.18
(71)申请人 南方医科大学珠江医院
地址 510282 广东省广州市海珠区工业大
道中253号
(72)发明人 汪艳 郑永见 潘明新 李阳
(74)专利代理机构 北京市立方律师事务所
11330
代理人 刘延喜 王增鑫
(51)Int.Cl.
G01N 1/28(2006.01)
G01N 1/30(2006.01)
G01N 1/34(2006.01)
G01N 33/533(2006.01)
G01N 21/64(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开一种超厚组织切片的制备方法，
其包括以下步骤：获取待观察的组织材料；制备
所述组织材料1～8mm的组织切片并对该组织切
光染。其次是一种组织切片三维组织形态结构
的再现方法，其包括以下步骤：制备厚度为1～
8mm的透明化组织切片；利用荧光显微镜获取组
织切片的图像数据；重组所述图像数据以形成三
维模型数据；基于所述三维模型数据输出三维图
像。本发明超厚组织切片的制备方法及三维组织
形态结构再现的方法，对组织切片进行除脂达到
透明以增加激光穿透肝组织的深度，减少光散
射，进而实现组织的深度成像，以更真实的状态
反映组织的细胞结构，同时提高了成像的效率和
保真度。权利要求书2页 说明书6页 附图3页CN 107727463 A 2018.02.23
C N 107727463
A
1.一种超厚组织切片的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：
获取待观察的组织材料；
制备所述组织材料1～8mm的组织切片并对该组织切片进行透明化；
对透明化的所述组织切片进行荧光染。
2.如权利要求1所述的超厚组织切片的制备方法，其特征在于，所述组织材料在制备组织切片之前进行以下至少一项预处理：
对所述组织材料进行表面清洗；
对所述组织材料进行内部的去血处理；
对所述组织材料进行化学固定。
3.如权利要求2所述的超厚组织切片的制备方法，其特征在于，所述组织材料来源于肝脏。
4.如权利要求3所述的超厚组织切片的制备方法，其特征在于，所述肝脏在制备成组织切片之前，采用穿刺灌注法对所述肝脏依次进行去血处理和化学固定处理。
5.如权利要求4所述的超厚组织切片的制备方法，其特征在于，所述去血处理过程使用肝素化的磷酸缓冲液作为灌注液；所述化学固定处理过程使用4％的多聚甲醛作为灌注液。
6.如权利要求1所述的超厚组织切片的制备方法，其特征在于，所述组织切片采用冷冻振荡切片法获得。
7.如权利要求6所述的超厚组织切片的制备方法，其特征在于，所述组织切片在进行透明化之前与水凝胶溶液孵育形成组织-水凝胶复合物。
8.如权利要求7所述的超厚组织切片的制备方法，其特征在于，以质量体积比计算，所述水凝胶溶液包括溶解在磷酸缓冲液中的4％的丙烯酰胺和0.25％引发剂。
9.如权利要求8所述的超厚组织切片的制备方法，其特征在于，所述引发剂选自二盐酸化物。
10.如权利要求9所述的超厚组织切片的制备方法，其特征在于，所述引发剂选自偶氮二咪唑啉基丙烷。
11.如权利要求8所述的超厚组织切片的制备方法，其特征在于，所述与水凝胶孵育的步骤包括：
在4℃的条件下将所述组织切片浸泡在所述水凝胶溶液中孵育2d；
孵育后对水溶胶溶液中的组织切片在13.3kPa的条件下抽真空10～15min；
在37℃的条件下继续以13.3kPa的压强抽真空2～3h，以促进发生组织和水凝胶之间的聚合反应。
12.如权利要求7所述超厚组织切片的制备方法，其特征在于，所述透明化的过程包括以下步骤：
在37℃的条件下，将组织-水凝胶复合物浸泡在透明液中进行振动洗脱，所述透明液每隔预定的时间更换一次，直至所述组织-水凝胶复合物变透明。
13.如权利要求12所述的超厚组织切片的制备方法，其特征在于，所述透明液为8％质量体积比的十二烷基硫酸钠溶液。
14.如权利要求13所述的超厚组织切片的制备方法，其特征在于，所述预定的时间为3d。
15.如权利要求1所述的超厚组织切片的制备方法，其特征在于，所述荧光染采用免疫荧光染法实现。
16.如权利要求15所述的超厚组织切片的制备方法，其特征在于，所述免疫荧光染法包括依次用一抗和二抗进行孵育的过程，所述一抗和二抗的孵育时间分别为3～7d。
17.如权利要求1或15所述的超厚组织切片的制备方法，其特征在于，所述组织切片进行荧光染之后，在80％体积比的甘油水溶液中保存备用。
18.一种细胞水平再现组织三维形态结构的方法，其特征在于，包括以下步骤：
制备厚度为1～8mm的透明化组织切片；
利用荧光显微镜获取组织切片的图像数据；
重组所述图像数据以形成三维模型数据；
基于所述三维模型数据输出三维图像。
19.如权利要求18所述的细胞水平再现组织三维形态结构的方法，其特征在于，所述透明化组织切片采用如权利要求1～17任意一项所述的超厚组织切片的制备方法获得。
20.如权利要求18所述的细胞水平再现组织三维形态结构的方法，其特征在于，在进行荧光显微镜观察
之前对所述组织切片进行封片，封片的具体步骤为：在载玻片上用蓝丁胶堆叠供所述组织切片置入的孔槽；将所述组织切片置入所述孔槽之后用80％的甘油填充；加盖盖玻片，以备观察。
21.如权利要求20所述的细胞水平再现组织三维形态结构的方法，其特征在于，所述蓝丁胶的堆叠厚度为组织切片的厚度的1.5倍。
22.如权利要求18所述的细胞水平再现组织三维形态结构的方法，其特征在于，利用双光子荧光显微镜观察所述组织切片，并获取所述组织切片的图像数据。
超厚组织切片的制备及细胞水平再现组织三维形态结构的
方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种生物组织显微观察领域，尤其涉及一种超厚组织切片的制备及细胞水平再现组织三维形态结构的方法。
背景技术
[0002]在对器官或组织的细胞或亚细胞结构的细节信息分析时，3-10μm的2D组织切片是实现该要求的常规方法。通常是将器官/组织固定后经石蜡包埋后切片(或冰冻切片)，然后进行相应的染后在显微镜下观察，该方法可以对器官/组织内的各种细胞类型及其分布进行形态学研究。但这种方法仅局限于某一平面水平并不一定能将器官/组织的整体包含在内，特别在对器官进行病理分析时，以肝脏为例，现有技术不能将肝脏病变部位包含在一个组织切片或若干连续的组织切片内，且许多肝脏疾病，例如肝癌其病灶与周围的结构(血管、神经、淋巴管等)的空间分布有着非常密切的联系，如果能够在保证组织完整的前提下从细胞或亚细胞结构水平观察这些病变，将对肝脏疾病甚至其他疾病的研究有重大贡献。对肝脏及其他器官进行三维结构观察时，CT、MRI以及PET等影像手段拥有出的组织成像深度，还具备越来越好的细节分辨能力，但这些影像学设备最高的分辨率(0.5-2.0mm)目前无法使成像效果达到细胞水平。
[0003]为了实现这一目标，现有技术之一，采用连续性切片染经显微镜观察获取图片后，利用计算机软件对图像进行拼接，实现了细胞水平的肝脏组织三维结构的观察。为了观察肝内胆管的形态结构的动态变化，研究者通过对取材的肝脏进行10μm厚度的连续性冰冻切片，胆管上皮细胞表面特异性抗原染(CK19)，然后经激光共聚焦显微镜获取图片后，将42-70张2D图片经计算机软件进行拼接(Z轴接近500μm)，从而得到了可用于观察和分析的3D结构的肝内胆管树图像。肝组织连续性机械切片结合3D图像重建技术，可以提供肝脏的全部图像，但从严格意义上说，基于这种3D图像重建技术形成的全肝图像是虚拟的，并不能完全代替真实的器官结构，且整个过程需要耗费大量的时间精力进行图像处理。
[0004]现有技术之二，采用100μm的厚组织切片(此厚度为显微镜扫描深度极限)进行相应的、染显微镜观察后，将获取的图片利用计算机进行分析重建，得到了肝血窦和胆小管的结构分布情况3D结构图像。利用厚组织切片(100μm)获取肝脏的3D结构图像，其局限在于受激光穿透深度、抗体的渗透限制，观察厚度≤100μm，因此Z轴的成像深度仍然小于单个肝小叶的直径，并不能达到理想的观察深度。
[0005]如何对各类细胞或亚细胞结构的进行理想深度的三维结构观察是人们现阶段对各种器官尤其是肝脏形态学研究热点。
发明内容
[0006]本发明的目的是，提供一种可以至少部分解决现有技术缺陷的细胞水平再现组织三维形态结构的方法，以及适用于该方法的超厚组织切片的制备方法。
[0007]为达到以上技术目的，本发明采用的技术方案如下：
[0008]首先是一种超厚组织切片的制备方法，其包括以下步骤：
[0009]获取待观察的组织材料；
[0010]制备所述组织材料1～8mm的组织切片并对该组织切片进行透明化；
[0011]对透明化的所述组织切片进行荧光染。
[0012]进一步地，所述组织材料在制备组织切片之前进行以下至少一项预处理：[0013]对所述组织材料进行表面清洗；
[0014]对所述组织材料进行内部的去血处理；
[0015]对所述组织材料进行化学固定。
[0016]一种可能的实施方式中，所述组织材料来源于肝脏。
[0017]进一步地，所述肝脏在制备成组织切片之前，采用穿刺灌注法对所述肝脏依次进行去血处理和化学固定处理。
[0018]具体地，所述去血处理过程使用肝素化的磷酸缓冲液作为灌注液；所述化学固定处理过程使用4％的多聚甲醛作为灌注液。
[0019]优选地，所述组织切片采用冷冻振荡切片法获得。
[0020]更优地，所述组织切片在进行透明化之前与水凝胶溶液孵育形成组织-水凝胶复合物。
[0021]具体地，以质量体积比计算，所述水凝胶溶液包括溶解在磷酸缓冲液中的4％的丙烯酰胺和0.25％引发剂。
[0022]可选择地，所述引发剂选自二盐酸化物。优选地，所述引发剂选自偶氮二咪唑啉基丙烷。
[0023]更具体地，所述与水凝胶孵育的步骤包括：
[0024]在4℃的条件下将所述组织切片浸泡在所述水凝胶溶液中孵育2d；
[0025]孵育后对水溶胶溶液中的组织切片在13.3kPa的条件下抽真空10～15min；[0026]在37℃的条件下继续以13.3kPa的压强抽真空2～3h，以促进发生组织和水凝胶之间的聚合反应。
[0027]更进一步地，所述透明化的过程包括以下步骤：
[0028]在37℃的条件下，将组织-水凝胶复合物浸泡在透明液中进行振动洗脱，所述透明液每隔预定的时间更换一次，直至所述组织-水凝胶复合物变透明。
[0029]较佳地，所述透明液为8％质量体积比的SDS溶液。较佳地，所述预定的时间为3d。[0030]进一步地，所述荧光染采用免疫荧光染法实现。
[0031]具体地，所述免疫荧光染法包括依次用一抗和二抗进行孵育的过程，所述一抗和二抗的孵育时间分别为3～7d。
[0032]优选地，所述组织切片进行荧光染之后，在80％体积比的甘油水溶液中保存备用。
[0033]其次是一种细胞水平再现组织三维形态结构的方法，其包括以下步骤：[0034]制备厚度为1～8mm的透明化组织切片；
[0035]利用荧光显微镜获取组织切片的图像数据；
[0036]重组所述图像数据以形成三维模型数据；
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