(10)申请公布号 (43)申请公布日 2014.02.19
C N 103588872
A (21)申请号 201210287219.5
(22)申请日 2012.08.13
C07K 14/765(2006.01)
C07K 14/77(2006.01)
C07K 14/795(2006.01)
C07K 1/113(2006.01)
G01N 33/82(2006.01)G01N 33/577(2006.01)G01N 33/543(2006.01)
(71)申请人北京博晖创新光电技术股份有限公
司
地址100195 北京市海淀区北坞村路甲25
号静芯园G 座
(72)发明人杨奇 崔建华
(74)专利代理机构北京路浩知识产权代理有限
公司 11002
代理人王朋飞 张庆敏
(54)发明名称
(57)摘要
本发明提供了一种维生素D 合成抗原及其制
载体的偶联物，所述维生素D 为25-羟基维生素
D3或1,25-二羟维生素D3，所述蛋白载体为牛血
清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、人血清白蛋白中
的一种或多种。本发明还提供所述维生素D 合成
一步提供维生素D 检测试剂盒，其集成了现有临
床维生素D 检测方法的优点，可适用于所有酶标
仪、化学发光仪和时间分辨分析仪，检测时间大大
缩短，且灵敏度、准确度、精密度均可满足检测要
求。采用本发明的通用性强的免疫吸附检测试剂
盒，可实现血清（或血浆）中维生素D 的批量、快速
检测。(51)Int.Cl.权利要求书1页 说明书8页
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书8页(10)申请公布号CN 103588872 A
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1.一种维生素D 合成抗原，其特征在于，其为维生素D 与蛋白载体的偶联物，所述维生素D 为25-羟基维生素D3或1,25-二羟维生素D3，所述蛋白载体为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、人血清白蛋白中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的合成抗原，其特征在于，所述维生素D 与蛋白载体的重量比为1:16~20。
3.制备权利要求1或2所述维生素D 合成抗原的方法，其特征在于，包括步骤：
1）将蛋白载体溶于pH8.5的缓冲液中，得溶液A ；
2）将维生素D 溶于乙醇、二甲基亚砜或吡啶中，得溶液B ；
3）分别向溶液A 和B 中加入活化剂，得到活化的蛋白载体和维生素D ；
4）以N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐或N,N'-二环己基碳二亚胺为偶联剂，将上述活化的蛋白载体和维生素D 进行偶联；
5）透析、干燥，即得维生素D 合成抗原；
其中，步骤3）中所述活化剂为含乙二胺和乙二胺的磷酸氢二钠溶液、4-二甲氨基吡啶-丙酮混合液、戊二醛或甲醛。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1）中所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液或Tris 缓冲液。
5.权利要求1或2所述维生素D 合成抗原在维生素D 免疫学检测中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，其是将所述维生素D 合成抗原与标记物结合作为竞争性抗原，通过与样品中的维生素D 竞争结合维生素D 单克隆抗体，从而检测样品中的维生素D 含量。 7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述标记物为:
a ）辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；
b ）吖啶酯类化合物；或
c ）螯合有Eu 3+、Sm 3+、Tb 3+或Dy 3+的二乙烯三胺五乙酸、2-[(4-氰基苯基)甲基]-1,4,7,10-四氮环十二烷-1,4,7,10-四乙酸或4,7-二氯磺基苯-1,10-菲罗啉-2,9-二羧酸。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述维生素D 单克隆抗体为Abcam 公司的维生素D 单抗产品。
9.维生素D 免疫学检测试剂盒，其特征在于，其包括包被维生素D 单克隆抗体的酶标板、权利要求1或2所述的维生素D 合成抗原经标记物标记后得到的竞争性抗原；
其中，所述维生素D 单克隆抗体为Abcam 公司的维生素D 单抗产品；所述标记物为：a ）辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；b ）鲁米诺或吖啶酯类化合物；或c ）螯合有Eu 3+、Sm 3+、Tb 3+或Dy 3+的二乙烯三胺五乙酸、2-[(4-氰基苯基)甲基]-1,4,7,10-四氮环十二烷-1,4,7,10-四乙酸或4,7-二氯磺基苯-1,10-菲罗啉-2,9-二羧酸。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括洗涤液、维生素D 标准品、底物显液、反应终止液中的一种或多种。权 利 要 求 书CN 103588872 A
一种维生素D合成抗原、其制备方法及应用
技术领域
[0001] 本发明涉及免疫学领域，具体地说，涉及一种维生素D合成抗原、其制备方法及应用。
背景技术
[0002] 维生素D是体内一类非常重要的维生素，在体内的主要作用是调节钙磷的代谢，同时和机体的健康状态也有很大的关系。
[0003] 维生素D的主要循环形式是25-羟基维生素D（包括25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3），它是最重要的维生素D新陈代谢产物，应用广泛。当体内缺乏维生素D时会引起一系列疾病。其中，1,25-二羟基维生素D3的生物学活性最大，1,25-二羟基维生素D3可以促进钙的吸收，并具有其它重要的生物学功能。
[0004] 由于维生素D的重要性，因此对于体内维生素D的含量检测也越来越受到人们的关注。
[0005] 由于维生素D的特殊分子结构，长时间以来都没有太好的检测方法，一般来说维生素D的检测花费时间较长，需要特殊的设备等，随着分子生物学技术的发展，目前用于测定25-羟基维生素D3的方法主要有放射竞争性蛋白结合法（CPB），放射免疫法（RIA），高效液相谱法（HPLC），罗氏的电化学发光法和英国IDS的酶联免疫法等。分别简述如下：[0006] （1）放射竞争性蛋白结合法
[0007] Wei S,Tanaka H,Kubo T等，A multiple assay for vitamin D metaboltes without high-performance liquid chromatography.Anal Biochem,1994,222(2):359-365文献中公开了一种无需HPLC纯化，仅0.5ml血清即可测定血清25（OH）D3含量的方法。主要步骤包括用乙腈提取血清，在C-18/OH柱和硅胶Sep-Pak 柱上分离和纯化，最后用维生素D结合蛋白法定量测定25（OH）D3，该方法有简便快
速，样本用量少、重复性好、可同时对维生素D的三种主要代谢产物进行定量等优点，但回收率较低。
[0008] （2）放射免疫法
[0009] 《中华妇产科杂志》1993年第3期中报道了用放射免疫法测定血清中的25-（OH）D3，该方法应用放射性元素标记示踪物，检测结果与放射性受体测定法高度相关，具有方法简便，灵敏度高，特异性好等优点，但其缺点在于标记的同位素不稳定，操作时对实验室要求很高，且产生的辐射对操作人员健康有不利影响。
[0010] （3）高效液相谱法
[0011] 即国标和药典中对维生素D的检测方法。谱分析法由于复杂的仪器设备和繁琐的过程，不适合临床大量样本筛查。
[0012] （4）电化学发光法
[0013] 目前罗氏公司采用的是电化学发光法测定血清中的25-（OH）D3，其原理是用电化学发光剂三联吡啶钌标记抗体，通过抗原-抗体反应和磁珠分离技术，根据三联吡啶钌在
电极上发出的光强度对待测定的抗原或抗体进行定量或定性。但其技术通用性差，需要用专用的设备，且设备成本较高。
[0014] （5）酶联免疫检测法
[0015] 应用ELISA法定量测定人血清、血浆、细胞培养物上清或其它相关液体中的25（OH）D3含量。基本原理是应用竞争酶联免疫分析法测定标本中25（OH）D3水平。用多克隆抗体包被微孔板，制成固相抗体，向包被多抗的微孔中依次加入25（OH）D3（样品）、生物素化的人25（OH）D3抗原、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝，并在酸的作用下转化成最终的黄。颜的深浅和样品中的25（OH）D3呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。此类试剂盒的缺点是用生物素标记25-羟基维生素D3，用HRP标记亲和素，且固相抗体选用多克隆抗体检测，特异性不强，且检测时间过长。
发明内容
[0016] 本发明的目的是提供一种新型的维生素D合成抗原、其制备方法及应用。[0017] 为了实现本发明目的，本发明的一种维生素D合成抗原，其为维生素D与蛋白载体的偶联物，所述维生素D为25-羟基维生素D3或1,25-二羟维生素D3，所述蛋白载体为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、人血清白蛋白中的一种或多种。其中，所述维生素D与蛋白载体的重量比为1:16~20。
[0018] 本发明还提供制备上述维生素D合成抗原的方法，包括以下步骤：1）将载体蛋白溶于pH8.5的缓冲液中，得溶液A；2）将维生素D溶于乙醇、二甲基亚砜或吡啶等试剂中，得溶液B；3）分别向溶液A
和B中加入活化剂，得到活化的蛋白载体和维生素D；4）以N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐或N,N'-二环己基碳二亚胺等为偶联剂，将上述活化的蛋白载体和维生素D进行偶联；5）透析、干燥，即得维生素D合成抗原。
[0019] 其中，步骤1）中所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液或Tris缓冲液。[0020] 步骤3）中所述活化剂为含乙二胺和乙二胺的磷酸氢二钠溶液、4-二甲氨基吡啶-丙酮混合液、戊二醛或甲醛等。活化剂优选为含乙二胺和乙二胺的0.05M磷酸氢二钠溶液pH10.4，其中乙二胺浓度为10%（v/v），乙二胺浓度为20mg/ ml。更优选活化剂为质量比21:80的4-二甲氨基吡啶-丙酮混合液。
[0021] 本发明还提供上述维生素D合成抗原在维生素D免疫学检测中的应用，其是将所述维生素D合成抗原与标记物结合作为竞争性抗原，通过与样品中的维生素D竞争结合维生素D单克隆抗体，从而检测样品中的维生素D含量。
[0022] 其中，所述标记物为:
[0023] a）辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；
[0024] b）吖啶酯类化合物；或
[0025] c）螯合有Eu3+、Sm3+、Tb3+或Dy3+的二乙烯三胺五乙酸（DTPA）、2-[(4-氰基苯基)甲基]-1,4,7,10-四氮环十二烷-1,4,7,10-四乙酸（DOTA）或4,7-二氯磺基苯-1,10-菲罗啉-2,9-二羧酸（BCPDA）等双功能螯合剂。
[0026] 所述维生素D单克隆抗体购自英国Abcam公司。
[0027] 本发明进一步提供维生素D免疫学检测试剂盒，其包括包被维生素D单克隆抗体的酶标板、上述维生素D合成抗原经标记物标记后得到的竞争性抗原。
[0028] 其中，所述维生素D单克隆抗体购自英国Abcam公司。
[0029] 所述标记物为：
[0030] a）辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；
[0031] b）吖啶酯类化合物；或
[0032] c）螯合有Eu3+、Sm3+、Tb3+或Dy3+的二乙烯三胺五乙酸（DTPA）、2-[(4-氰基苯基)甲基]-1,4,7,10-四氮环十二烷-1,4,7,10-四乙酸（DOTA）或4,7-二氯磺基苯-1,10-菲罗啉-2,9-二羧酸（BCPDA）等双功能螯合剂。
[0033] 优选前述检测试剂盒中还包括洗涤液、维生素D标准品、底物显液、反应终止液等中的一种或多种。
[0034] 本发明首次提供维生素D合成抗原及其制备方法，将小分子的维生素D直接连接于载体蛋白上，并通过在蛋白载体上连接免疫检验用的示踪物，例如辣根过氧化物酶（或碱性磷酸酶）、荧光素（如镧系元素螯合物）、化学发光剂（鲁米诺或吖啶酯）等，因此，可适用于大多数免疫学检测方法。
[0035] 本发明提供的维生素D检测试剂盒，其集成了现有临床维生素D检测方法的优点，可适用于所有酶标仪、化学发光仪和时间分辨分析仪，实现了一步检测法，与两步法相比，检测时间大大缩短，且灵敏度、准确度、精密度均可满足检测要求。采用本发明的通用性强的免疫吸附检测试剂盒，可实现血清（或血浆）中维生素D的批量、快速检测。
具体实施方式
[0036] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。[0037] 实施例1 25-羟基维生素D3抗原的合成及酶联免疫试剂盒的制备
[0038] 1.1 25-羟基维生素D3抗原的合成
[0039] A、将100mg牛血清白蛋白（BSA）溶于10ml pH8.5 0.05M的磷酸盐缓冲液中；[0040] B、将5mg 25-羟基维生素D3溶于0.5ml乙醇中，再加入二琥珀酰亚胺基碳酸酯108mg（预先溶于400μl二甲基甲酰胺中），室温下将所述混合物避光搅拌过夜（一般为16~22h）；
[0041] C、向溶解的牛血清白蛋白液中加入2ml含乙二胺和乙二胺的0.05M pH10.4的磷酸氢二钠溶液（磷酸氢二钠缓冲液中乙二胺浓度为10v/v%，乙二胺浓度为20mg/ml），在室温下反应3~4小时；
[0042] D、反应完成后向C所得溶液中加入37%甲醛溶液1ml，室温下避光搅拌均匀；[0043] E、将B所得溶液滴加至D的溶液中，室温下避光搅拌过夜；
[0044] F、将终产物用0.01M pH7.4磷酸盐缓冲液透析16小时，每4小时更换一次透析液。[0045] 1.2用辣根过氧化物酶(HRP)标记合成抗原
[0046] G、称取5mg HRP溶解于1ml蒸馏水中；
[0047] H、向上述溶液中加入0.2ml新配制的0.1M NaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟；[0048] I、将上述溶液装入透析袋中，用1mM pH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜；
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