(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011109866.8
(22)申请日 2020.10.16
(71)申请人 威海纽普生物技术有限公司
地址 264200 山东省威海市火炬高技术产
业开发区山海路288-6号
(72)发明人 李红江 辛晓文 孙荣同 王有志
王鹏浩
(74)专利代理机构 威海科星专利事务所 37202
代理人 初姣姣
(51)Int.Cl.
G01N 33/558(2006.01)
G01N 33/543(2006.01)
G01N 33/577(2006.01)
G01N 21/64(2006.01)
(54)发明名称阿尔茨海默病标志物p-Tau217检测试剂盒及其制造方法(57)摘要本发明涉及荧光免疫层析技术领域，具体的说是一种灵敏度高、测试周期短的阿尔茨海默病标志物p ‑Tau217检测试剂盒及其制造方法，其特征在于，其中结合垫上分别吸附有稀土荧光羧基微球标记的亲和素‑生物素化的p ‑Tau217检测抗体复合物及荧光羧基微球‑鸡IgY复合物；包被膜上T线包被p ‑Tau217捕获抗体、C线包被羊抗鸡I g Y 抗体；所述稀土荧光羧基微球的直径为200nm ‑350nm，稀土荧光羧基微球掺杂稀土镧系元素，在基态下稳定，在340‑380nm的激发光源作用下发射出波长范围在600‑630nm的荧光；所述抗体为纯化后的单克隆抗体，来源于针对2‑6个不同的p ‑ Tau217抗原表位的单克隆抗体细胞株。权利要求书2页 说明书7页 附图2页CN 112505322 A 2021.03.16
C N 112505322
A
1.一种阿尔茨海默病标志物p-Tau217检测试剂盒，设有试纸卡，所述试纸卡设有PVC 板，PVC板上依次设有相搭接的样品垫、结合垫、反应垫、包被膜、吸水垫，其特征在于，其中结合垫上分别吸附有稀土荧光羧基微球标记的亲和素-生物素化的p-Tau217检测抗体复合物及荧光羧基微球-鸡IgY复合物；包被膜上T线包被p-Tau217捕获抗体、C线包被羊抗鸡IgY 抗体；所述稀土荧光羧基微球的直径为200nm-350n
m，稀土荧光羧基微球掺杂稀土镧系元素，在基态下稳定，在340-380nm的激发光源作用下发射出波长范围在600-630nm的荧光；所述抗体为纯化后的单克隆抗体，来源于针对2-6个不同的p-Tau217抗原表位的单克隆抗体细胞株。
2.一种阿尔茨海默病标志物p-Tau217检测试剂盒，其特征在于，所述结合垫的稀土荧光羧基微球的直径范围是200-250nm；所述稀土荧光羧基微球掺杂有稀土镧系元素，为铕(Eu)、钐(Sm)、铒(Er)、钕(Nd)等镧系元素的任意一种或几种的混合物；所述稀土荧光羧基微球掺杂稀土络合物；结合垫上稀土荧光羧基微球标记的抗体来源于针对3个不同抗原表位的单克隆细胞细胞株。
3.一种如权利要求1或2所述阿尔茨海默病标志物p-Tau217检测试剂盒的制造方法，其特征在于，所述结合垫采用如下步骤制得：将玻璃纤维膜浸泡于0.1M硼砂-硼酸pH8.8、0.1％Tween80及0.1％酪蛋白、0.05％P300处理液中，4℃浸泡2小时，然后取出37℃烘箱烘干24小时，备用，将玻璃纤维膜在Bio-DotXYZ3050三维喷点平台上，用Bio-Jet Quanti300非接触式微定量喷头将稀土荧光羧基微球标记的亲和素-生物素化的p-Tau217检测抗体复合物及荧光羧基微球-鸡IgY复合物喷到玻璃纤维膜，37℃烘干2小时后制得；
其中结合垫上的稀土荧光羧基微球标记亲和素-生物素-p-Tau217单克隆抗体及荧光羧基微球-鸡IgY采用如下步骤制得：
步骤1：单克隆抗体细胞株的获得：参照p-Tau217氨基酸序列，选择抗原性强的位点人工合成20个氨基酸左右的多肽序列，交联到KLH上，采用标准的单克隆抗体制备方法制备特异性高亲和力的单克隆抗体细胞株，将所获得的细胞株对应的单克隆抗体进行配对实验和亲和力测定实验，根据实验结果确定捕获抗体和检测抗体；
步骤2：单克隆抗体的制备：采用标准的腹水生产工艺制备并纯化用于检测的p-Tau217单克隆抗体，分装后保存于-20℃备用；
步骤3：稀土荧光羧基微球标记的生物素话的p-Tau217单克隆抗体的制备：将1mg用于链霉亲和素和与稀土荧光羧基微球混合，通过EDC/NHS的作用，4℃反应过夜，将亲和素和羧基微球偶联；然后，加入终浓度为2％Gly，4℃反应4小时封闭；然后用100mM Tris-HCL，pH8.5的缓冲液采用离心法洗涤3遍，重悬于1mL的100mM pB7.2缓冲液中，然后加入0.5mg生物素化的p-Tau217抗体，37℃孵育20分钟，然后离心10分钟，弃上清，沉降的微球-亲和素-生物素化的p-Tau217抗体复合物用0.1M Tris-HCL 8.0、4％海藻糖、0.1％Tween20重悬；
步骤4：稀土荧光羧基微球标记的鸡IgY的制备：将1mg鸡IgY和与稀土荧光羧基微球混合，通过EDC/NHS的作用，4℃反应过夜，将鸡IgY和羧基微球偶联；然后，加入终浓度为2％Gly，4℃反应4小时封闭；然后用100mM Tris-HCL，pH8.5的缓冲液采用离心法洗涤3遍，然后离心10分钟，弃上清，沉降的微球-IgY复合物用0.1M Tris-HCL 8.0、4％海藻糖、0.1％Tween20重悬，4℃储存备用。
4.一种如权利要求3所述阿尔茨海默病标志物p-Tau217检测试剂盒的制造方法，其特
征在于，所述包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜通过以下步骤制得：根据配对实验和亲和力测定实验，选择用于捕获的抗体对应的单克隆抗体细胞株，按照标准的腹水生产工艺制备并纯化用于捕获的p-Tau217单克隆抗体，保存于-20℃备用；
分别用包被稀释液将p-Tau217单克隆抗体和羊抗鸡IgY抗体调整浓度到1-5mg/ml，膜液量为1-2μl/cm，将它们分别作为检测线和质控线平行喷洒于硝酸纤维素膜上进行包被，检测线和质控线间隔为3-7mm，然后置于烘箱中，37℃烘干96小时。
阿尔茨海默病标志物p-Tau217检测试剂盒及其制造方法
技术领域：
[0001]本发明涉及荧光免疫层析技术领域，具体的说是一种灵敏度高、测试周期短的阿尔茨海默病标志物p-Tau217检测试剂盒及其制造方法。
背景技术：
[0002]目前诊断阿尔茨海默氏病的方法包括：通过PET扫描测量淀粉样蛋白(一种与痴呆有关的蛋白质)的
沉积；或使用腰椎穿刺术定量脑脊液中的淀粉样蛋白和tau蛋白。然而，PET扫描价格昂贵，仅在专门的医疗中心提供，目前尚不包括在保险范围内；而腰穿是侵入性的，并且不易在大量人中进行。
[0003]随着基础医学的研究发现，通过检测血液中某种蛋白质水平，可以确诊阿尔茨海默病(俗称早老性痴呆症)，最早可在病症出现前 20年确诊。检测其中蛋白质p-Tau217水平有所增加，即能确诊阿尔茨海默病。在患者出现症状之前，其大脑和脊髓液中的p-Tau217水平已经增加。瑞典隆德大学研究人员发现，阿尔茨海默病患者 p-Tau217水平是未患病的人大约7倍。对于携带有一种罕见基因、先天易患阿尔茨海默病的人，出现病症20年前血液中的p-Tau217 水平就开始增高。血液p-Tau217的诊断精度与已建立的诊断方法一样高，包括正电子发射断层扫描(PET)成像和脑脊液生物标志物，这些方法具有侵入性，成本高且易获得的缺点。
[0004]研究表明p-Tau217血液含量很低，健康体血液浓度低于 1.9pg/mL，而携带相关基因突变，但是尚未出现认知功能损害的参与者其血液浓度达到4.5pg/mL，而出现认知功能损害的参与者该指标达到16.8pg/mL，差异非常显著。但是，要实现在快检平台实现该浓度检测的灵敏度，对检测技术是个很大的挑战。
[0005]免疫分析技术是利用微量抗原与相应的高特异性抗体之间的免疫反应，来检测如激素、药物、蛋白质、多肽、酶、肿瘤相关抗原、微生素、病毒、细菌及金属元素等生物体内活性物质。免疫分析技术
包括标记免疫分析、非标记免疫分析和仪器免疫分析。本试剂盒利用的含有稀土元素的羧基微球标记免疫分析技术是属于标记免疫分析之一种。
[0006]荧光免疫分析(FIA)和放射免疫分析(RIA)自问世以来，经历了几十年的发展，但是人们越来越感觉到FIA因自然本地太高，干扰检测结果；RIA采用同位素标记，对人体有极大危害并给实验带来不便。酶免疫分析(EIA)也因酶本身不稳定，受其他影响因素较大，推广应用受到限制。80年代初，人们开始研究用稀土元素代替荧光物质和同位素标记蛋白质或抗体，将时间分辨技术引入到生物检测领域，建立了新型的超微量时间分辨荧光免疫分析技术(Time resolved Fluoroimmunoassay，简称TrFIA)。该技术采用多学科先进技术，集结了其他免疫分析的特点，在免疫学、分子生物学、细胞学和医学等领域，取得长足的发展和广泛应用。
[0007]TrFIA利用了具有独特荧光特性的3价稀土离子及螯合物为示踪物代替荧光物质、酶、同位素、化学发光物质，标记抗体、抗原、激素、多肽、蛋白质、核酸探针及生物细胞，待反应体系(如抗原抗体反应、核酸探针杂交、生物素亲和素反应以及靶细胞对效应细胞的杀伤
效应等)发生后，用TrFIA检测仪测定反应产物中的荧光强度。根据产物荧光强度和相对荧光强度的比值，判断反应体系中分析物的浓度，从而达到定量分析。在通常的荧光测定中，由于测试样品中含有多种荧光成分，背景荧光(来自样品中的胶体颗粒和溶剂分子引起的散射光以及血清中蛋白质和其他化合物
发出的非特异性荧光) 强度大、干扰强，成为荧光分析法大范围推广的瓶颈。TrFIA之所以能够成为继EIA、RIA之后一种新的灵敏的检测方法，主要取决于镧系元素独特的荧光特点、检测中采用的波长分辨和时间延迟技术以及解离-增强技术。
[0008]镧系元素(lanthanide,Ln)属于稀土元素，共有17中，常用于 TrFIA主要有铕(Eu)、钐(Sm)、铽(Tb)、镝(Dy)。镧系元素具有独特的荧光发光特点，与普通荧光相比，镧系离子螯合物荧光衰变时间长，为传统荧光的103-106倍。如镧系离子螯合物的荧光衰变时间在60-900μs，常用的Eu3+荧光衰变时间为714μs，普通荧光免疫分析中荧光团的荧光衰变时间只有1-100μs，样品中一些蛋白质的荧光衰变时间仅为1-10μs，因此利用时间分辨技术，延迟一定时间后测量，便可获得Eu3+特异性荧光信号。同时由于衰变时间长，Eu3+标记物在测量时间里可以反复被激发，每次激发后由激发态很快跃迁到基态，就有荧光发出，然后又可被重新激发，如此每秒可有1000次激发，使得TrFIA荧光标记物的相对比活性很高。镧系元素荧光光谱的最大特征是激发光与发射光之间的Stokes位移较大， Eu3+激发波长为337nm，发射波长为615nm，Stokes位移可达278nm；同时Eu3+被激发的荧光光带极窄，荧光的发射峰非常尖锐，可使仪器调整在极窄的波长范围内测定，这样就几乎完全消除了背景荧光的干扰，继而通过时间延迟和波长分辨，将强特异性荧光和背景荧光辨开(故称为时间分辨)，使干扰达到几乎为零。
[0009]生物素－亲和素系统(Biotin-Avidin—System，BAS)是70年代末发展起来的一种新型生物反应放大系统。随着各种生物素衍生物的问世，BAS很快被广泛应用于医学各领域。近年大量研究证实，生物素—
亲和素系统几乎可与目前研究成功的各种标记物结合。生物素与亲和素之间高亲合力的牢固结合以及多级放大效应，使BAS免疫标记和有关示踪分析更加灵敏。它已成为目前广泛用于微量抗原、抗体定性、定量检测及定位观察研究的新技术。
[0010]生物素(biotin，B)广泛分布于动、植物组织中，常从含量较高的卵黄和肝组织中提取，分子量244.31Da.生物素分子有两个环状结构(如图)，其中Ⅰ环为咪唑酮环，是与亲和素结合的主要部位； II环为噻吩环，C2上有一戊酸侧链，其末端羧基是结合抗体和其他生物大分子的唯一结构，经化学修饰后，生物素可成为带有多种活性基团的衍生物——活化生物素。活化生物素可以在蛋白质交联剂的介导下，与已知的几乎所有生物大分子偶联，包括蛋白质，核酸，多糖，脂类等。
[0011]亲和素(avidin，AV)亦称抗生物素蛋白、卵白素，是从卵白蛋白中提取的一种由4个相同亚基组成的碱性糖蛋白，分子量为68kD，等电点pI＝10.5；耐热并耐受多种蛋白水解酶的作用.尤其是与生物素结合后，稳定性更好。生物素与亲和素间的作用是目前已知强度最高的非共价作用，亲和常数(K)为1015mol/L，比抗原与抗体间的亲和力(K＝105～1011mol/L)至少高1万倍。并且，二者的结合稳定性好专一性强，不受试剂浓度，PH环境，抑或蛋白变性剂等有机溶剂影响。由于每个亲和素能结合4个分子的生物素，这一特点可以用于构建一个多层次信号放大系统。因此，BAS即可用于微量抗原、抗体及受体的定量、定性检
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