(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010327490.1
(22)申请日 2020.04.23
(66)本国优先权数据
201911077572.9 2019.11.06 CN
(83)生物保藏信息
CGMCC 19404 2020.01.17
(71)申请人 上海健康医学院
地址 201318 上海市浦东新区周祝公路279
号
(72)发明人 黄钢 李斌
(74)专利代理机构 广东德而赛律师事务所
44322
代理人 叶秀进
(51)Int.Cl.
C12P 13/10(2006.01)
C12N 15/77(2006.01)C12N 15/66(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本申请公开了一种固定化酶连续制备[14/
15N]-L -瓜氨酸的方法，属于酶学与酶工程技术
于填充床反应器；再将包含[14/15N]-L -精氨酸的
溶液在20-55℃条件下，以流速0.3-0.5BV/h流经
填充床反应器进行反应，反应液经分离、纯化即
可得到[14/15N]-L -瓜氨酸。本发明的技术构思
是采用cipA固定化融合蛋白为载体将精氨酸脱
亚胺酶arc固定于包涵体蛋白cipA上，产生具有
催化活性的包涵体蛋白cipA -arc，即cipA -arc融
合蛋白。本申请提供的具有催化活性的固定化
cipA -精氨酸脱亚胺酶cipA -arc融合蛋白，能连
续反应560小时以上；同时得到的具有同位素标
记的[14/15N]L -瓜氨酸，为前列腺疾病、心血管疾
病等的诊断与提供了有效途径。权利要求书2页 说明书10页序列表6页CN 111518851 A 2020.08.11
C N 111518851
A
1.一种固定化酶连续制备[14/15N]-L-瓜氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将包含固定化酶的融合蛋白悬浮于填充床反应器；
(2)将包含[14/15N]-L-精氨酸的溶液在20-55℃条件下，以流速0.3-0.5BV/h流经填充床反应器进行反应，反应液经分离、纯化即可得到[14/15N]-L-瓜氨酸。
2.根据权利要求1所述的固定化酶连续制备[14/15N]-L-瓜氨酸的方法，其特征在于，步骤(1)中所述包含固定化酶的融合蛋白为采用cipA为载体将精氨酸脱亚胺酶arc固定于包涵体蛋白cipA上得到的具有催化活性的包涵体蛋白cipA-arc，即cipA-arc融合蛋白，所述cipA-arc融合蛋白由以下步骤制备：
(2)采用重组质粒pXMJ19-cipA-arc电击转化步骤(1)所述的谷氨酸棒杆菌感受态细胞，得到重组菌体全细胞； (3)将步骤(2)所述得到的重组菌经基因工程菌诱导表达得到的重组菌体全细胞，经超声破碎、离心后，所得的沉淀即为cipA-arc融合蛋白。
3.根据权利要求2所述的固定化酶连续制备[14/15N]-L-瓜氨酸的方法，其特征在于，所述谷氨酸棒杆菌感受态细胞采用如下制备方法：
将谷氨酸棒杆菌ATCC13032在含LBG固体培养基中培养后，挑取新鲜菌株接种于LBG液体培养基中，经培养后按0.8-1.5％的接种量将活化菌液转接至LBG培养基中，继续培养至OD600为0.8-1.0；将菌液经冰水混合物预冷、离心，吸出上清液后加入甘油，吹吸至菌体悬浮，再次经离心、吸出上清液后加入甘油，吹吸至菌体悬浮，即可得到谷氨酸棒杆菌感受态细胞。
4.根据权利要求3所述的固定化酶连续制备[14/15N]-L-瓜氨酸的方法，其特征在于，所述重组质粒pXMJ19-cipA-arc电击转化感受态细胞采用如下制备方法：
取谷氨酸棒杆菌感受态细胞和重组质粒pXMJ19-cipA-arc混匀，冰上冷却后，在相同温度条件下，以电击条件为电压1-5kV，电击1-10ms；再在室温下加入LBG液体培养基，转移到离心管中，经振荡培养后取所得液体涂布于含氯霉素抗性平板，挑选单菌落提取质粒，再通过双酶切、PCR确认目的片段的插入，得到的重组菌接种。
5.根据权利要求4所述的固定化酶连续制备[14/15N]-L-瓜氨酸的方法，其特征在于，所述基因工程菌的诱导表达方法如下：
将重组菌接种于含氯霉素的LBG培养基中，经摇床培养至菌体OD600值达到0.8-1.0时加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，经诱导过夜后离心收集重组菌体全细胞，用Tris-HCl缓冲液洗涤菌体后重悬于磷酸缓冲液，超声破碎细胞后再次离心，沉淀即为获得的cipA-arc融合蛋白。
6.根据权利要求2所述的固定化酶连续制备[14/15N]-L-瓜氨酸的方法，其特征在于，所述的重组质粒pXMJ19-cipA-arc采用如下方法制备：
(1)将cipA基因序列在DNA5’端引入HindIII位点，3’端引入SalI位点，得到基因序列为SEQ ID NO.1的片段，合成的片段经过测序后，用HindIII/SalI双酶切目标基因和表达载体pXMJ19，酶切产物经过凝胶回收后，将目标片段和载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得阳性转化子表达载体pXMJ19-cipA；
(2)将精氨酸脱亚胺酶arc基因序列在DNA5’端引入XhoI位点，3’端引入SacI位点，得到基因序列为SEQ ID NO.2的片段，合成的片段经过测序后，用XhoI/SacI双酶切目标基因和表达载体pXMJ19-cipA，酶切产物经过凝胶回收后，将目标片段和载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得阳性转化子重组质粒pXMJ19-cipA-arc，即为含精氨酸脱亚胺酶的基因工程菌。
7.根据权利要求6所述的固定化酶连续制备[14/15N]-L-瓜氨酸的方法，其特征在于，所述的含精氨酸脱亚胺酶的基因工程菌保藏名称为谷氨酸棒杆菌SUMHS-2020.01，分类命名为Corynebacterium glutamicu
m，该菌株已于2020年1月17日保藏于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏中心的保藏编号为CGMCC No.19404。
8.根据权利要求7所所述的固定化酶连续制备[14/15N]-L-瓜氨酸的方法，其特征在于，所述的含精氨酸脱亚胺酶的基因工程菌中表达精氨酸脱亚胺酶。
9.根据权利要求1所述的固定化酶连续制备[14/15N]-L-瓜氨酸的方法，其特征在于，步骤(1)中所述包含固定化酶的融合蛋白酶活力为9000-12000U，所述步骤(2)中包含[14/15N]-L-精氨酸的溶液中[14/15N]-L-精氨酸的浓度为1.0-2.5mol/L。
10.根据权利要求1所述的固定化酶连续制备[14/15N]-L-瓜氨酸的方法，其特征在于，所述包含[14/15N]-L-精氨酸的溶液还包含醋酸铵缓冲溶液、甲酸铵缓冲溶液、氯化铵水溶液、碳酸氢铵水溶液或纯水溶液中的任意一种；
优选地，所述包含[14/15N]-L-精氨酸的溶液还包含醋酸铵缓冲溶液、甲酸铵缓冲溶液、氯化铵水溶液或碳酸氢铵水溶液中的任意一种。
一种固定化酶连续制备[14/15N]-L-瓜氨酸的方法
技术领域
[0001]本申请涉及一种生产高纯度[14/15N]-L-瓜氨酸的方法，尤其是一种利用重组精氨酸脱亚胺酶分解[14/15N]-L-精氨酸生产高纯度[14/15N]-L-瓜氨酸的方法，属于酶学与酶工程技术领域。
背景技术
[0002]L-瓜氨酸(L-citrulline)是一种特殊氨基酸。参与体内多种代谢过程，如清除自由基，异体排斥效应指示剂，血管舒张作用，稳定血压以及诊断类风湿关节炎，抗氧化等，防止前列腺疾病和提高性功能，抗衰老以及增强免疫力等，应用前景十分广阔。
[0003]生产L-瓜氨酸的方法有：化学法、发酵法、酶法。化学法是指在碱性条件下水解L-精氨酸得L-瓜氨酸，水解过程控制比较困难，产品中含有旋光对映体D-瓜氨酸，影响产品质量，而且生产过程中产生大量废水，污染环境；发酵法生产的难点在于单位体积L-瓜氨酸产率低，从发酵液中提取L-瓜氨酸操作工艺复杂，收率低，成本高；酶法生产是指在精氨酸脱亚胺酶的作用下，L-精氨酸被转化为L-瓜氨酸，该法具有专一性强，产品浓度高的优点，但这种方法也存在催化剂利用率不高，即每一次生产后都得重新发酵制备菌体，这不但需要消耗大量的原料，而且会产生大量的废水，增加环保处理成本；以及由酶催化剂带入反应体系的杂质(大量的菌体、蛋白和发酵液残留的各种金属离子等杂质)，导致在L-瓜氨酸后处理过程中，产物分离纯化要经过一系列的除菌体、除蛋白和离交柱等工艺步骤，进一步增加生产成本。
[0004]由于化学法、发酵法或酶法生产L-瓜氨酸均有许多缺点，导致生产成本高居不下，给实际推广应用带来了很大困难。
[0005]为了克服这些问题，提出了固定化酶或细胞的解决方案，固定化酶或细胞的制备方法有物理法和化学法两大类。物理方法包括物理吸附法、包埋法等。物理法固定酶的优点在于酶不参加化学反应，整体结构保持不变，酶的催化活性得到很好保留。但是，由于包埋物或半透膜具有一定的空间或立体阻碍作用，因此对一些反应不适用。化学法包括结合法、交联法。化学法酶与载体之间结合紧密，不易脱落，稳定性好，但反应条件激烈，操作复杂，控制条件苛刻，活力损失较大。
[0006]2008年郑璞(郑璞，倪晔，张文.填充床反应器中固定化假单胞菌细胞连续制备L-瓜氨酸[J].食品与生物技术学报，2008，27(5)：1673-1689)等报道了填充床反应器中固定化假单胞菌细胞连续制备L-瓜氨酸可在0.0108g·(h.g)-1(每小时每克细胞产生的瓜氨酸克数)条件下进行连续54d运转，但是菌体发酵生产过程复杂，而且固定化细胞时间过长，底物浓度低，产量不高，固定化细胞虽然简单，但仍然存在胞体破碎释放菌体中的杂蛋白及其它有机物质的问题，增加了反应体系中产物的分离纯化的难度，而且细胞固定化也增加操作的步骤，增大了生产成本。
发明内容
[0007]根据本申请的第一方面，提供了一种固定化酶连续制备[14/15N]-L-瓜氨酸的方法，所述方法包括
如下步骤：
[0008](1)将包含固定化酶的融合蛋白悬浮于填充床反应器；
[0009](2)将包含[14/15N]-L-精氨酸的溶液在20-55℃条件下，以流速0.3-0.5BV/h流经填充床反应器。
[0010]可选地，步骤(1)中所述包含固定化酶的融合蛋白步骤(1)中所述包含固定化酶的融合蛋白为9000-12000U，优选为10000U，所述步骤(2)中包含[14/15N]-L-精氨酸的溶液中[14/15N]-L-精氨酸的浓度为1.0-2.5mol/L。
[0011]可选地，步骤(1)中所述填充床反应器为径高比为15-40，体积为450-2000mL的玻璃柱。
[0012]可选地，所述包含[14/15N]-L-精氨酸的溶液中[14/15N]-L-精氨酸的浓度为1.0-2.5mol/L。
[0013]可选地，步骤(1)中所述包含固定化酶的融合蛋白为采用cipA为载体将精氨酸脱亚胺酶arc固定于包涵体蛋白cipA上得到的具有催化活性的包涵体蛋白cipA-arc，即cipA-arc融合蛋白。
[0014]可选地，所述cipA-arc融合蛋白由以下步骤制备：
[0015](1)制备谷氨酸棒杆菌感受态细胞；
[0016](2)采用重组质粒pXMJ19-cipA-arc电击转化步骤(1)所述的谷氨酸棒杆菌感受态细胞，得到重组菌；
[0017](3)将步骤(2)所述得到的重组菌经基因工程菌诱导表达得到的重组菌体全细胞，经超声破碎、离心后，所得的沉淀即为cipA-arc融合蛋白。
[0018]可选地，所述谷氨酸棒杆菌感受态细胞由如下方法制备：
[0019]将谷氨酸棒杆菌ATCC13032在含LBG固体培养基中培养后，挑取新鲜菌株接种于LBG液体培养基中，经培养后按0.8-1.5％的接种量将活化菌液转接至LBG培养基中，继续培养至OD600为0.8-1.0；将菌液经冰水混合物预冷、离心，吸出上清液后加入甘油，吹吸至菌体悬浮，再次经离心、吸出上清液后加入甘油，吹吸至菌体悬浮，即可得到谷氨酸棒杆菌感受态细胞。
[0020]作为优选方案，将谷氨酸棒杆菌ATCC13032划线于含LBG固体培养基的平板中，于培养箱培养，待菌体长出挑取新鲜菌株接种于LBG液体培养基中，于温度为20-40℃转速为150-300r/min摇床中培养12-24h；按1％接种量将活化菌液转接至LBG培养基中，于温度为20-40℃转速为150-300r/min摇床中培养至OD600约为0.9；将菌液置于冰水混合物中预冷15-20min，再于超净台中将预冷的菌液分装至灭菌的离心管中，4℃6000g离心30s，冰水放置2min；将离心管中的上清液吸出，向离心管中各加入预冷的10％甘油，用移液缓慢吹吸至菌体悬浮；悬浮液于4℃6000g离心30s，将离心管中的上清液吸出，向
离心管中加入预冷的10％甘油，用移液缓慢吹吸至菌体悬浮。
[0021]可选地，所述培养的温度均为30℃；所述培养时的转速均为200r/min。
[0022]可选地，所述重组质粒pXMJ19-cipA-arc电击转化感受态细胞由如下方法制备：[0023]取谷氨酸棒杆菌感受态细胞和重组质粒pXMJ19-cipA-arc混匀，冰上冷却后，在相
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议