(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201611258115.6
(22)申请日 2016.12.30
(71)申请人 江苏万邦生化医药集团有限责任公
司
地址 221004 江苏省徐州市金山桥经济开
发区杨山路6号
申请人 上海复星医药（集团）股份有限公司
(72)发明人 文良柱 赵珊珊 胡婷 刘慧萍
(51)Int.Cl.
C12N 9/64(2006.01)
C12N 15/57(2006.01)
C12N 15/70(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明提供了一种制备重组肠激酶的方法，
白序列从N端到C端依次包括：100-250个氨基酸
序列、肠激酶序列；（2）切除融合蛋白N端所述的
100-250个氨基酸序列获得重组肠激酶，所述重
组肠激酶的氨基酸序列为Seq ID No.1，核苷酸
序列为Seq ID No.4。本发明所述方法制备工艺
简单、成本低，无需经过变性和复性，并且纯化步
骤简单方便制备的重组肠激酶活性高。
权利要求书2页 说明书8页序列表6页 附图4页CN 108265042 A 2018.07.10
C N 108265042
A
1.一种重组肠激酶的制备方法，其特征在于，该方法包括：
（1）重组表达融合蛋白，所述融合蛋白序列从N端到C端依次包括：100-250个氨基酸序列、肠激酶序列；
（2）切除融合蛋白N端所述的100-250个氨基酸序列获得重组肠激酶，所述重组肠激酶的氨基酸序列为Seq ID No.1，核苷酸序列为Seq ID No.4。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述的100-250个氨基酸序列为Seq ID No.2或Seq ID No.3。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中重组表达融合蛋白的优化的核苷酸序列为Seq ID No.7或Seq ID No.8。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述核苷酸序列两端分别添加了NdeI/ XhoI酶切位点，插入带有NdeI/XhoI酶切位点的pCOLD系列的冷诱导表达载体中；所述NdeI/ XhoI酶切位点的核苷酸序列为：NdeI:CATATG ，XhoI:CTCGAG。
5.一种在大肠杆菌中可溶性表达重组肠激酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)培养包含肠激酶的融合蛋白基因的工程菌并诱导融合蛋白的表达；所述融合蛋白的序列从N端到C端依次包括：100-250个氨基酸序列、肠激酶序列；
(2)收集菌体；
(3)破碎菌体；
(4)收集上清；
(5)纯化上清中的融合蛋白；
(6)酶切上述纯化后的融合蛋白，切除融合蛋白N端所述的100-250个氨基酸序列；产生有活性的重组肠激酶；
(7)纯化上述重组肠激酶，所述重组肠激酶的氨基酸序列为Seq ID No.1，核苷酸序列为Seq ID No.4。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤的(1)中的工程菌为大肠杆菌BL21 (DE3)；诱导融合蛋白的表达选用浓度为0.1mM至10mM的诱导剂IPTG，在10-15℃下进行冷诱导。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述诱导融合蛋白的表达的具体方法为：接种重组工程菌阳性克隆100ul到20ml的LB培养基中，于30-37℃下摇床振荡培养过夜，按4%接种量接过夜菌于500ml的LB培养基，30-37℃下摇床振荡培养到对数期，接种到装有6L 培养基的发酵罐中，初始参数为：发酵温度30-37℃，搅拌速度200-300rpm，通气量15L/min，pH为6.5-7.5，控制搅拌转速与通气量以维持溶氧始终在30%以上，培养基配方如下：发酵培养基：酵母浸出粉30g/L，葡萄糖6g/L，十二水合磷酸氢二钠8g/L，磷酸二氢钾4g/L，硫酸铵6g/L，七水硫酸镁1.13g/L，二水氯化钙0.073g/L；补料培养基：酵母浸出粉20g/L，葡萄糖30g/L；50%氨水和30%磷酸用于发酵过程中pH调控；当培养基中养分耗尽，溶氧迅速上升时开始补料，控制补料速度、转速、通气保证控制溶氧在30%以上；补料5hr-8hr后，降温至10-15℃，调节pH至6.5-7.5，加入终浓度0.1 -1mmol/L的IPTG进行有氧诱导，溶氧不低于20%，继续培养10h后出罐，收集菌体。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)破碎菌体的方法为高压匀浆、渗透压冲击、冻融或超声波破碎；步骤(5)纯化上清中的融合蛋白，采用疏水填料Phenly 6FF进
行纯化，平衡液为20-50mM Tris-HCL+0.5-1M (NH 4)2SO 4硫酸铵，pH8.0；洗脱液为20-50mM Tris-HCL，pH8.0。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(6)的具体方案为融合蛋白经肠激酶在室温下酶解8-16小时后即可得到具有活性的重组肠激酶；其中肠激酶和融合蛋白的重量比优选为1:200~1:1000。
10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(7)活性重组肠激酶的纯化步骤优选为离子交换层析。
一种重组肠激酶的制备方法
技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组肠激酶的制备方法。
背景技术
[0002]肠激酶( Enterokinase，EK，EC3.4.21.9) 是一种异源二聚体形式存在于哺乳动物十二指肠内的丝氨酸蛋白酶。它能高效专一性的水解工程菌表达的融合蛋白（识别位点是Asp-Asp-Asp-Asp-Lys）释放出目的蛋白，被广泛用于生物工程制药的开发。牛肠激酶由一条结构亚基（重链）和一条催化亚基（轻链）构成，二者以二硫键结合。据Vozza等报道，重组肠激酶轻链体外具有全酶的酶切特异性，同时对基因工程融合蛋白底物的酶切活性较提纯的牛肠激酶明显增强。天然肠激酶来源有限，且从动物组织提取的肠激酶易污染其他蛋白，给实际应用带来了困难。这就要求用基因工程方法生产高纯度的肠激酶。
[0003]目前基因工程生产的肠激酶（轻链）已经开始商业化，大多数是在大肠杆菌中通过基因重组的方法而制备。但该方法往往表达得到不具活性的胰蛋白酶原包涵体，需要使胰蛋白酶原包涵体经过变性、复性过程，然后再经过酶切切去酶原的前体部分才能得到有活性的酶。而在所述变性、复性过程中，复
性率不可能达到100%，因此该方法费时费力，产率不高。
发明内容
[0004]本发明的目的之一是提供制备重组肠激酶的方法，该方法避免了形成包涵体，解决了因分子量大而难分泌表达的难题。
[0005]本发明的目的之二是提供一种在大肠杆菌中可溶性表达肠激酶的方法，该方法制备得到的包含肠激酶的融合蛋白直接酶切去除融合蛋白N端100-250个氨基酸后即可得到有活性的重组肠激酶，并且后续的纯化步骤也简单方便。
[0006]本发明的第一方面，提供一种制备重组肠激酶的方法，该方法包括：（1）重组表达融合蛋白，所述融合蛋白序列从N端到C端依次包括：100-250个氨基酸序列、肠激酶序列；
（2）切除融合蛋白N端所述的100-250个氨基酸序列获得重组肠激酶，所述重组肠激酶的氨基酸序列为Seq ID No.1，核苷酸序列为Seq ID No.4。
[0007]在一个优选实例中，步骤（1）中，融合蛋白N端所述的100-250个氨基酸序列包含除半胱氨酸以外的其他19种标准氨基酸；具体地，其氨基酸序列和核苷酸序列分别为Seq ID No.2和Seq ID No.5。
[0008]在另一个优选实例中，步骤（1）中，融合蛋白N端所述的100-250个氨基酸序列包含20种标准氨基酸；具体地，其氨基酸序列和核苷酸序列分别为Seq ID No.3和Seq ID No.6。[0009]本发明第二方面，提供一类冷诱导表达载体，包含编码所述的融合蛋白核苷酸序列。具体的，该表达载体属于pCOLD系列，如：pCOLDI (含TEE序列，His tag序列、Factor Xa 切断序列)、pCOLDII (含TEE序列，His tag序列)、pCOLDIII (含TEE序列)、pCOLDIV。为于便
于纯化，本发明优选pCOLDI。
[0010]在一个优选实例中，为插入pCOLDI中，在融合蛋白的核苷酸序列时，两端分别添加了NdeI/XhoI酶切位点；作为一种优选方案，融合蛋白的核苷酸序列并进行优化，优化后的核苷酸序列为Seq ID No.7或Seq ID No.8，再于两端引入NdeI/XhoI酶切位点，然后插入质粒pCOLDI的NdeI/XhoI酶切位点；所述NdeI/XhoI酶切位点的核苷酸序列为：NdeI:CATATG ，XhoI:CTCGAG。
[0011]本发明第三方面，提供一种在大肠杆菌中可溶性表达肠激酶的方法，该方法包括如下步骤：
(1)培养包含肠激酶的融合蛋白基因的工程菌并诱导融合蛋白的表达；
(2)收集菌体；
(3)破碎菌体；
(4)收集上清；
(5)纯化上清中的融合蛋白；
(6)酶切上述纯化后的融合蛋白，产生有活性的重组肠激酶；
(7)纯化上述重组肠激酶。
[0012]步骤的(1)中的工程菌为大肠杆菌BL21(DE3)，本发明的方法对大肠杆菌宿主的种类没有任何限制。优选那些能够直接表达构象正确的目的蛋白的宿主。将前述表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)的转化方法在本领域是公知的，例如电穿孔法、CaCl 2转化法等。
[0013]步骤的(1)中的诱导宿主表达蛋白的方法可采用本领域技术人员所公知的技术。在本发明优选的实施方式中，是在诱导表达过程中，使用浓度为0.1mM至10mM的诱导剂IPTG，在10-15℃下进行冷诱导，使得目的蛋白更高效的表达。更优选的具体方案为：接种重组工程菌阳性克隆100ul到20ml的LB培养基中，于30-37℃下摇床振荡培养过夜，按4%接种量接过夜菌于500ml的LB培养基，30-37℃下摇床振荡培养到对数期，接种到装有6L培养基的发酵罐中，初始参数为：发酵温度30-37℃，搅拌速度200-300rpm，通气量15L/min，pH为
6.5-
7.5，控制搅拌转速与通气量以维持溶氧始终在30%以上，培养基配方如下：发酵培养基：酵母浸出粉30g/L，葡萄糖6g/L，十二水合磷酸氢二钠8g/L，磷酸二氢钾4g/L，硫酸铵6g/L，七水硫酸镁1.13g/L，二水氯化钙0.073g/L；补料培养基：酵母浸出粉20g/L，葡萄糖30g/L；50%氨水和30%磷酸用于发酵过程中pH调控；当培养基中养分耗尽，溶氧迅速上升时开始补料，控制补料速度、转速、通气保证控制溶氧在30%以上；补料5hr-8hr后，降温至10-15℃，调节pH至6.5-7.5，加入终浓度0.1 -1mmol/L的IPTG进行有氧诱导，溶氧不低于20%，继续培养10h后出罐，收集菌体。
[0014]步骤(3)破碎菌体的方法可以为高压匀浆、渗透压冲击、冻融或超声波破碎。
[0015]步骤(5)纯化上清中的融合蛋白，优选采用疏水填料Phenly 6FF进行纯化，平衡液为20-50mM Tris-HCL+0.5-1M (NH 4)2SO 4硫酸铵，pH8.0；洗脱液为20-50mM Tris-HCL，pH8.0。
[0016]步骤(6)优选的具体方案为融合蛋白经肠激酶在室温下酶解8-16小时后即可得到具有活性的重组肠激酶；其中肠激酶和融合蛋白的重量比优选为1:200~1:1000。
[0017]步骤(7)活性重组肠激酶的纯化步骤优选为离子交换层析。
[0018]与现有技术相比，本发明所提供的制备重组肠激酶的方法具有以下优点：
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