(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011238096.7
(22)申请日 2020.11.09
(71)申请人 绍兴迅敏康生物科技有限公司
地址 312000 浙江省绍兴市越城区贤路
口与中兴大道东南角五楼503室
(72)发明人 胡彬 王烨凤 褚嘉豪 蔡媛媛
(74)专利代理机构 无锡市汇诚永信专利代理事
务所(普通合伙) 32260
代理人 李珍珍
(51)Int.Cl.
C12Q 1/6806(2018.01)
(54)发明名称
试剂盒
(57)摘要
本发明提供一种病原体微生物宏基因组去
宿主方法及试剂盒，特别适用于肺泡灌洗液、脑
脊液、痰液以及腹水等病原微生物宏基因组检
一致及人细胞浓度，基因组大小与真菌，细菌，病
毒浓度及基因组大小有显著差异的特点，选择变
主的作用，其中变性剂至少包括saponin、吐温
20、Triton X ‑100、digitonin以及CHAPS的一种
或多种；该病原体微生物宏基因组可在5‑20分钟
内完成去宿主操作，该方法可提高病原体微生物
宏基因组的检测灵敏度。权利要求书1页 说明书7页CN 112322701 A 2021.02.05
C N 112322701
A
1.一种病原体微生物宏基因组去宿主方法，其特征在于，包括以下步骤：
宿主细胞裂解：取检测样本加入变性剂孵育去人源细胞得到第一反应液，其中变性剂至少包括saponin、吐温20、Triton X -100、digitonin以及CHAPS
的一种或多种；
宿主核酸去除：配置添加有DNase Ⅰ酶的缓冲液，混合第一反应液和添加有DNase Ⅰ酶的缓冲液孵育去除宿主核酸，得到第二反应液；
病原体微生物核酸提取。
2.根据权利要求1所述的病原体微生物宏基因组去宿主方法，其特征在于，缓冲液的成分包括：Tris -HCl，
MgCl 2以及DTT。
3.根据权利要求1所述的病原体微生物宏基因组去宿主方法，其特征在于，变性剂的试剂选择：0.1-10％的saponin，0-2％的Triton X -100，0.1-4％的Digitonin，0-3％的CHAPS。
4.根据权利要求1所述的病原体微生物宏基因组去宿主方法，其特征在于，适用于肺泡灌洗液、脑脊液、痰液、腹水的宏基因组检测。
5.一种病原体微生物宏基因组去宿主试剂盒，其特征在于，包括：
变性剂，其中变性剂选自saponin、吐温20、Triton X -100、digitonin以及CHAPS的一种或多种；
缓冲剂；
DNase Ⅰ酶；
溶菌酶，或溶壁酶。
6.根据权利要求5所述的病原体微生物宏基因组去宿主试剂盒，其特征在于，缓冲液的成分包括：Tris -HCl，MgCl 2以及DTT。
7.根据权利要求5所述的病原体微生物宏基因组去宿主试剂盒，其特征在于，变性剂的试剂选择：0.1-10％的saponin，0-2％的Triton X -100，0.1-4％的Digitonin，0-3％的CHAPS。
8.根据权利要求5所述的病原体微生物宏基因组去宿主试剂盒，其特征在于，适用于肺泡灌洗液、脑脊液、痰液、腹水的宏基因组检测。
9.一种病原体微生物宏基因组去宿主提取系统，其特征在于，包括：
去宿主模块，其中去宿主模块至少包括saponin、吐温20、Triton X -100、digitonin以及CHAPS的一种或多种；
宿主核酸去除模块，其中宿主核酸去除模块包括缓冲剂和DNase Ⅰ酶，其中缓冲剂包括Tris -HCl，MgCl 2以及DTT；
病原体微生物核酸提取模块，其中病原体微生物核酸提取模块包括溶菌酶或溶壁酶。
10.根据权利要求9所述的病原体微生物宏基因组去宿主提取系统，其特征在于，适用于肺泡灌洗液、脑脊液、痰液、腹水的宏基因组检测。
权 利 要 求 书1/1页CN 112322701 A
一种病原体微生物宏基因组去宿主方法及试剂盒
技术领域
[0001]本发明涉及生物检测领域，特别涉及一种病原体微生物宏基因组去宿主方法及试剂盒。
背景技术
[0002]高通量测序技术〔又称下一代测序技术(NGS)〕越来越广泛地应用于感染性疾病的溯源、检测、分型和耐药评估等各个方面，并且朝着快捷、经济的方向飞速发展。2008年和2011年，Palacios等人与Xu等人分别采用宏基因组及宏转录组发现了两个临床感染病例的新发病原体，分别为沙粒病毒和新型布尼亚病毒，开启了宏基因组学测序(mNGS)技术在临床感染中应用的先例。由于mNGS不依赖于特定基因引物的序列扩增，而是将待测样本的所有DNA或RNA混合测序，并通过将测序数据与病原体数据库进行比对，获得病原体的分类信息，因此能在较短的时间内完成对样本的无靶向检测，单次即可检测上千种病原体，检测的病原体种类包含病毒、细菌、真菌和寄生虫等。
[0003]然而，大多数的临床样本，比如肺泡灌洗液，脑脊液被广泛应用于宏基组病原微生物检测，然而此类样本中含有大量人细胞，且人细胞基因组为病原体微生物的10-10000倍，导致宏基组测序得到测序数据90％以上的测序序列为人源序列，从而大大影响宏基因组病原微生物检出灵敏度，如何高效地去宿
主化提取是临床病原微生物宏基因组测序的关键。[0004]目前常用的去宿主方法有：过滤法，将样本通过5um的微滤膜进行过滤取过滤后样本进行宏基组测序，然后测试结果与未过滤测试结果人源序列占比无显著差异，且病原微生物检测率也无显著差异。酶切法，将样本直接用DNaseⅠ进行消化后，然后进行宏基组测试，虽然测试结果中人源序列占比稍微有所下降，但病原微生物检测序列无显著提高。探针捕获法，设计反向特异性的捕获人源基因组，然后将剩余的样本用于检测，该方法成本高，流程较长，且效果较差。
[0005]另外，针对不同的病原微生物的去宿主还需考虑到病原微生物本身的特性，病原微生物的去宿主方法之间也难以直接相通借用。比如针对痰液样本来说，由于其内含有大量的粘液、细胞及蛋白、病原微生物被包裹在痰液中，因此对其去宿主的过程需要先对痰液进行液化，然而在痰液液化的过程虽然可以富集细菌、真菌等病原体，但同时也会导致人细胞富集、病毒、衣原体、寄生虫等病原体减少，因此特别针对痰液的去宿主方法并不一定适用于针对病毒的去宿主方法。
发明内容
[0006]本发明的目的在于提供一种病原体微生物宏基因组去宿主方法及试剂盒，特别适用于肺泡灌洗液、脑脊液等病原微生物宏基因组检测，利用人细胞和细菌，真菌，病毒等细胞结构不一致及人细胞浓度，基因组大小与真菌，细菌，病毒浓度及基因组大小有显著差异的特点，选择特异性的变性剂溶解细
胞并酶消化人细胞核酸，可在5-20分钟内达到去宿主的作用，可提高病原体微生物宏基因组的检测灵敏度。
[0007]为了实现以上目的，第一方面，本方案提供一种病原体微生物宏基组去宿主提取方法，特别适用于肺泡灌洗液、脑脊液、痰液、腹水等病原微生物宏基组检测，包括：[0008]宿主细胞裂解：取检测样本加入变性剂孵育去人源细胞得到第一反应液，其中变性剂至少包括皂素(saponin)、聚氧乙烯(20)山梨醇酐单月桂酸酯(吐温20)、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、毛地黄皂苷(digitonin)以及CHAPS的一种或多种，这些变性剂的共性是可温和地破裂人细胞；
[0009]宿主核酸去除：配置添加有DNaseⅠ酶的缓冲液，混合第一反应液和添加有DNaseⅠ酶的缓冲液孵育去除宿主核酸，得到第二反应液；
[0010]病原体微生物核酸提取。
[0011]在宿主细胞裂解步骤之前可富集样本；取样本离心后保留沉淀及上清液，随后可将沉淀和上清液加入变性剂中。
[0012]其中富集样本的离心条件可以是在1000-4000rpm离心。
[0013]在宿主细胞裂解步骤中：saponin；吐温20；digitonin；CHAPS作为温和的变性剂可裂解人细胞
且对微生物和病毒影响很小；Triton X-100作为一种非离子去垢剂可以溶解脂质，对微生物细胞影响较弱，对人细胞有较好的裂解作用，可充分保留微生物的细胞结构。[0014]在本方案的实施例中，变性剂的试剂选择：0.1-10％的saponin，0-2％的Triton X-100，0.1-4％的Digitonin，0-3％的CHAPS；即此处提供对应变性剂的浓度范围，本方案选择的变性剂的浓度是基于以下考虑得到：高浓度的变性剂会影响后续加入DNase I酶的活性。
[0015]在本方案的实施例中，宿主细胞裂解的孵育条件选择为室温孵育5-20分钟。[0016]在宿主核酸去除步骤中，本方法特别选择DNaseⅠ酶作为消化酶是基于DNaseⅠ酶在上述变性剂的环境中依然拥有非常好得酶切活性的特性，可以将释放到溶液中得人的核酸和游离的核酸进行消化。DNaseⅠ酶的作用是消化游离的核酸，实验测试其可以在低浓度的变性剂的条件下依然拥有良好的酶活性。
[0017]另，与传统的去宿主方法不同的是：本方案可直接利用变性剂对原始样本进行处理后再加入缓冲剂，进行核酸消化，这是由于使用的变性剂为温和的变性剂，可以裂解液人细胞，但对微生物和病毒的影响较小，当变性剂加入时人细胞裂解，人的核酸大部分释放到溶液中，故溶液中主要含有大量人游离的核酸和少量微生物释放的核酸，完整的微生物和病毒，加入的DnaseⅠ酶消化的大部分为人的游离的核酸。
[0018]本方案选择的缓冲液的成分包括：Tris-HCl，MgCl2以及DTT，其中：Tris-HCl可提供PH6-9稳定
的缓冲环境，MgCl2能增加金属依赖性核酸酶的活性，促进裂解后游离暴露出来的宿主核酸的降解，DTT的作用能保护酶分子上的还原性基团，维持还原性环境，稳定酶的活性。
[0019]在本方案的实施例中，缓冲液的比例添加条件可选择为：300Mm-500 Mm Tris-HCl，60-100mM MgCl2，30-80mM DTT；DNaseⅠ的比例可以是0.5—6U。
[0020]在本方案的实施例中，宿主核酸去除的孵育条件选择为37℃中孵育5-20min。[0021]在病原体微生物核酸提取步骤中，选择溶菌酶或溶壁酶进行微生物的细胞壁破壁。具体的，去人源后样本在80℃孵育2min后冷却至室温在溶液中直接加入溶菌酶或者溶壁酶，在37℃孵育5-30min后使用商业核酸提取试剂盒进行核酸提取。
[0022]由于细菌细胞壁主要成分是肽聚糖组成，溶菌酶可以有效地水解细菌细胞壁中的肽聚糖，进而对微生物的细胞壁进行破壁释放微生物的核酸。
[0023]在核酸提取完成后，按照标准的建库流程进行核酸建库，建库完进行浓度定量然后用illumina或者华大的测序仪器进行测试上机，结束后再使用生信分析软件进行分析。[0024]第二方面，本发明提供一种病原体微生物宏基组去宿主提取试剂盒，包括：[0025]变性剂：其中变性剂至少包括皂素(saponin)、聚氧乙烯(20)山梨醇酐单月桂酸酯(吐温20)、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、毛地黄皂苷(digitonin)以及CHAPS的一种或多种；
[0026]缓冲剂：Tris-HCl，MgCl2以及DTT；
[0027]DNaseⅠ酶；以及
[0028]溶菌酶或溶壁酶。
[0029]其中变性剂营造温和的变性条件，可破坏人细胞中磷脂双分子层，从而裂解细胞释放其核酸到溶液中，其中DNaseⅠ酶添加到缓冲剂中用于消化裂解液中的人细胞核酸，其中溶菌酶用于破坏微生物的细胞壁。
[0030]在一些实施例中，变性剂的试剂选择：0.1-10％的saponin，0-2％的Triton X-100，0.1-4％的Digitonin，0-3％的CHAPS。
[0031]关于缓冲剂和DNaseⅠ酶的浓度、试剂盒的使用方法、使用条件等选择参见病原体微生物宏基组去宿主提取方法中所述。
[0032]第三方面，本发明提供一种病原体微生物宏基组去宿主提取系统，包括：[0033]去宿主模块，其中去宿主模块至少包括：皂素(saponin)、聚氧乙烯(20)山梨醇酐单月桂酸酯(吐温20)、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、毛地黄皂苷(digitonin)以及CHAPS的一种或多种；
[0034]宿主核酸去除模块，其中宿主核酸去除模块包括缓冲剂和DNaseⅠ酶，其中缓冲剂包括Tris-HCl，MgCl2以及DTT；
[0035]病原体微生物核酸提取模块，其中病原体微生物核酸提取模块包括溶菌酶或溶壁酶。
[0036]相较现有技术，该病原体微生物宏基因组去宿主方法带来的有益效果是：脑脊液，肺泡灌洗液、痰液、腹水等常用病原微生物宏基组检测样本在saponin(皂素)，吐温20，Triton X-100，CHAPS等一系列温和变性剂的作用，破坏人细胞中磷脂双分子层，从而裂解人细胞释放其核酸到溶液中，而细菌，真菌细胞拥有细胞壁结构使得其不受这些变性剂影响，从而保持细胞结构的完整性；病毒拥有膜蛋白结构，从而使得其保持完整的病毒结构，即在去宿主环节利用人细胞、细菌、真菌以及病毒等细胞结构不一致的特点，选择特异性的变性剂溶解人细胞然后用酶消化人核酸；然后立即在反应溶液中加入Tris-HCl，MgCl2，DTT 缓冲液和DNaseⅠ酶，DNaseⅠ酶在上述变性剂中依然拥有非常好的酶切活性，可以将释放到溶液中的人核酸和游离的核酸进行消化；由于样本中人细胞相对多且人基因组为病原微生物基因组的10-10000倍，所以DNaseⅠ消化的核酸基本上为人的基因组，从而达到去除人宿主的目的。通过本方案处理后的样本用于第二代高通量宏基组病原体微生物及第三代纳米孔病原体微生物检测，可以大大提供其检测灵敏度。
[0037]另，值得说明的是：该病原体微生物宏基因组去宿主方法直接对原始样本进行处
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