细胞自噬检测的具体步骤及方法

一、自噬体介绍

自噬（Autophagy），或称自体吞噬，是一个涉及到细胞自身结构通过溶酶体机制而被分解的过程，该过程是一个受到紧密调控的步骤，帮助细胞产物在合成、降解以及接下来的循环中保持一个平衡状态。细胞接受自噬诱导信号后，在胞浆的某处形成一个扁平的类似“脂质体”样的膜结构，称为Phagophore。随着Phagophore不断延伸，将胞浆中的细胞器等成分，全部包裹住成为密闭的结构，称为“自噬体（autophagosome）”。自噬体形成后，可与溶酶体融合，自噬体中的内容物随即被降解，产物（氨基酸、脂肪酸等）被输送到胞浆中，供细胞重新利用，而残渣或被排出细胞外或滞留在胞浆中。自噬信号通路：

谢希德二、自噬研究策略和方法

正常细胞基础水平自噬活性比较低，对自噬研究通常需要进行人工调节和干预，常用药物有：

1、自噬诱导剂

a) Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模拟内质网应激；

b) Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化锂）：IMPase 抑制剂（即Inositol monophosphatase，肌醇单磷酸酶）；

c) Earle's平衡盐溶液：制造饥饿；

d) N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制剂；

e) Rapamycin：mTOR抑制剂；

f) Xestospongin B/C：IP3R阻滞剂。

2、自噬抑制剂

a) 自噬抑制剂3-Methyladenine（3-MA）：(Class III PI3K) hVps34 抑制剂；

b) Bafilomycin A1：质子泵抑制剂；

c) 溶酶体抑制剂Hydroxychloroquine（羟氯喹）。

3、自噬检测

1) 透射电镜；

电镜作为自噬检测的金指标。由于自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下观察不到自噬体的形成，因此，直接观察自噬体需在透射电镜下。Phagophore的特征为：新月状或杯状，双层或多层膜，有包绕胞浆成分的趋势。自噬体（AV1）的特征为：双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体（AV2）的特征为：单层膜，胞浆成分已降解。

2) WB检测标志物LC3/Atg8、p62/SQSTM1、Lamps、Atg5、Atg14和Beclin-1；

a）利用Western Blot检测LC3-II/I比值的变化以评价自噬形成。自噬形成时，胞浆型LC3（即LC3-I）会酶解掉一小段多肽，转变为（自噬体）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。寡头竞争

b）利用Western Blot检测p62蛋白来评价自噬以及自噬流的强弱：p62蛋白水平的多少与自噬流的强弱有着反比例关系。

3) 组织蛋白酶Cathepsin活力检测；

4) IF检测自噬潮autophagic flux。

三、自噬研究常规思路

通常情况下，除了研究自噬现象本身，大家更多的是将自噬与各种生命活动或者疾病结合起来，把自噬作为这些方向的一个机制来研究。比如研究自噬如何参与肿瘤的发生发展、如何参与肿瘤的耐药性与复发转移、如何参与肿瘤免疫的效果、如何参与炎症反应、如何参与氧化应激，如何参与自闭症、阿尔兹海默症的发生与等，通常的研究模式：

1）证明自噬参与了相关研究表型（电镜、LC3II/I-WB、LC3亚细胞定位、LC3荧光示踪监测自噬流等）

2）证明自噬在表型中起到关键作用（通过自噬抑制剂、激动剂进行关联研究）

3）到表型与自噬桥梁分子（检测pI3K通路、Beclin-1、ATG 家族各成员）

商标法实施细则4）在基因层面通过gain of/lost of function研究桥梁分子在自噬中的作用。

研载生物可以为客户提供从自噬领域的课题设计到实验操作包括后续实验结果的整理等服务。

量子态隐形传输技术

四、自噬相关研究领域

1）自噬起始和终止的分子机制

模糊综合评价法2）细胞自噬与肿瘤

3）细胞自噬与免疫

4）自噬参与炎症信号通路的调节

5）细胞自噬与神经退行性疾病

6）激活自噬促进免疫化疗和放疗

7）表观遗传学与细胞自噬的关系

混沌模式8）药物自噬

五、自噬病毒工具

多种自噬病毒研究工具可以提供，便于直接感染目的细胞后直观地观察细胞自噬的整体水平。

1、GFP-LC3单荧光自噬指示病毒系统

GFP-LC3病毒系统可高效感染目的细胞，表达GFP-LC3，感染感染后细胞可在荧光显微镜下实时观察自噬的整体水平；由于电镜耗时长，不利于监测自噬形成。我们利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了GFP-LC3指示技术：无自噬时，GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，

本文发布于:2024-09-25 16:39:36，感谢您对本站的认可！

本文链接：https://www.17tex.com/xueshu/77719.html

上一篇：动物免疫学实验技术-红细胞免疫功能检测技术

下一篇：细胞周期检测protocol

标签：细胞自噬研究参与胞浆形成检测结构

留言与评论（共有 0 条评论）