循环肿瘤细胞检测及临床应用
中文摘要：循环肿瘤细胞是从原发肿瘤扩散，进入到血液或淋巴系统的肿瘤细胞。循环肿瘤细胞在血液中含量稀少，一般先将循环肿瘤细胞富集，然后再进行检测，现在已经开发了多种细胞富集和检测技术。本文主要对CTCs的富集和检测技术研究进展，以及CTCs在临床分析和研究上的应用进行了综述。 动物学杂志关键词：循环肿瘤细胞富集检测临床
Abstract: Circulating tumor cells come from the primary tumor proliferation,andproliferation, and then enter into the blood or lymphatic system. Circulating tumor cells are rare in the blood. Generally, circulating tumor cells should be enriched first, and then detected. A variety of cell enrichment and detection technologies have been developed. This paper reviews the research progress in CTCs enrichment and detection techniques, as well as analysis of CTCs in clinical and research.
Key words: Circulating tumor cells enrichmentcells detectionenrichment detection clinical扑杀
癌症转移的过程是循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells，CTCs)从原发肿瘤分离，通过循环系统扩散，进入血液或者淋巴系统，在远处形成新的肿瘤，最终导致大多数的癌症病人死亡[1]。1869年，Ashworth在一例癌症死亡患者的外周血中发现了类似肿瘤的细胞，并首次提出了CTCs的概念[2]。从此，越来越多的研究表明，CTCs的出现与癌症密切相关。通过上皮-间质转化(EMT)，实体瘤的上皮细胞进行细胞的变化，使他们通过增加流动性和侵袭性脱离组织，进入到血液中，附着，、发展成远端转移[3]。由于CTCs能够代表原发肿瘤的表型和遗传组成，并能够作为任何转移性肿瘤的”液体活检”，CTCs的富集分离和特征研究，十分具有吸引力。CTCs的富集和计数技术已经建立，其中CTCs的计数可以成为预测指标，当其大于已知的阈值时，就预示着病人就患有转移性乳腺癌[4]，、前列腺癌[5]，、结直肠癌等[6]。
王茂俊基于临床试验，美国FDA批准了一种临床检测CTCs的Cell Search技术，用于上述癌症的CTCs的富集和计数。Cell Search技术成功的证明了CTCs确实表征了疾病的活跃，CTCs 数量的增加预示着病情的恶化，可以通过CTCs了解原发性和转移性肿瘤，以CTCs为基础东芝m30
的分析，可以帮助人们实时诊断和预测，对病情做出决定，并取样检测耐药性。大多数常规的癌症方法在转移性癌症方面难以成功，CTCs的可能促进肿瘤的临床研究。
CTCs在血液中极其稀少，数十亿的外周血细胞也阻碍了对CTCs的分离和分子鉴定。现在已经开发了大量的技术用于富集和检测CTCs，其中有些已经成功的用于测试或者临床评估。本文主要综述CTCs的富集和检测技术的研究进展，以及对CTCs的在临床分析和研究上应用。
1CTCs富集技术
为了从大量血液细胞中捕获数量稀少的CTCs，富集分离技术必须足够敏感性，可重复性，可靠，、快速，、便宜，并且所需获取血液量要尽量少，方便实现过程自动化，方便下游分析。此外，富集分离的CTCs要能够保持他们的活性，在富集分离的过程受到的干扰要尽量小，因为这可能改变CTCs的状态和表型[7]。
CTCs富集的技术有很多种，这些技术使用多个性能参数评估(即捕获效率，纯度，细胞活力，富集速度，血液样本容量等)，然后通过检测临床样本进行验证。最佳的富集分离方
法可能需要之间的性能参数的折衷，而且可能依赖于下游的应用。CTCs的富集技术主要根据免疫亲和性，物理性质和直接分析分为三类。
1.1免疫亲和性(Immunoaffinity)
以免疫亲和性为基础的CTCs富集主要是利用捕获抗体(如EpCAM抗体)和CTCs靶抗原(如EpCAM)之间的高度特异性。基于EpCAM抗体的富集技术有很多种，主要区别在于捕获的方法有所不同。抗体捕获的方法主要有以下几种。 1.1.1免疫磁珠法(Magnetic beads)
免疫磁珠法富集CTCs主要是利用捕获抗体(如EpCAM抗体)和CTCs抗原(如EpCAM)之间的高度特异性反应，免疫作用促使抗原与耦合到磁珠的抗体发生特异性的结合，然后抗原-抗体复合物被置于磁场作用之下，通过磁场对磁珠固定从而使CTCs与其他血液细胞分离，产生富集效果。
Cell Search系统是免疫磁珠方法应用的典型代表。在该方法中，经过密度梯度离心富集的外周血被收集到含有防凝剂的收集管中，然后被放置到一个自动化的制备系统。该系统利
用免疫磁珠富集EpCAM阳性的细胞。捕获效率主要与EpCAM的表达水平有关。有研究表明在EpCAM高表达的细胞中，有大约75%的捕获效率，而在EpCAM低表达的细胞中，大概只有42%的表达捕获效率。在检测的过程中，富集的细胞与CD45，CK的抗体孵育，然后用DAPI染。CK和CD45分别用PE和APC荧光标记，然后，EpCAM阳性的CTCs 被anti-ck-PE抗体标记，而白细胞被anti-CD45-APC抗体标记。标记的细胞被CellTrack Analyzer 计数和分析，最终，CTCs是CK+/DAPI+/CD45-，而白细胞是CK-/DAPI+/CD45+。系统的这种半自动特征使得样本的检测非常迅速，而且具有很好的重复性[8]。
磁铁清扫装置(magnetic sweeper device)是新开发出来的技术，磁铁清扫装置提高被磁珠包被的EpCAM抗体的捕获能力。这种技术的可以达到62%的捕获效率，51%的纯度，9ml/L 的通量[9]。用这种磁珠清扫设备用RT-PCR的方法从30个转移性乳腺癌病人中的21个病人的血液中检测出了CTCs[10]。
磁性筛装置(magnetic sifter device)，通过微阵列的形式在磁场孔边缘产生极高的磁性区域，在富集过程中使用垂直流动构造，可以增强捕获效率到91.4%，提高了处理速度，最优达到10ml/h[11]。
AdnaTest(Adnagen AG，Langenhagen，Germany)是一个商业化的设备，它采用了磁珠与各种癌症(如乳腺癌，直结肠癌，前列腺癌，卵巢癌)的特异性抗体进行鸡尾酒式结合，并用多重RT-PCR的方式检测CTCs，这套实验装置已经真是可用于转移性乳腺癌，卵巢癌。比较研究发现，Adna Test breast cancer装置从55个转移性乳腺癌病人中的29个病人血液中检测出了CTCs，而Cell Search装置只从26个检测出了CTCs[12]。
Fig 1 Cell Search富集检测CTCs流程
1.1.2CTC-chip
电脑爱好者2012CTC-chip是一种基于免疫亲和以及芯片的CTCs检测技术，在970mm2的表面上，排列了78000个被EpCAM抗体包被的硅微柱，用于捕获CTCs。通过抽气产生压力使血液样品以1-2ml/h的速度不间断的从芯片表面通过。这种缓慢的流速可以保证CTCs吸附在EpCAM 包被的微处理器上。而这种硅微柱提供了大量的表面积用于接触，从而使EpCAM表达高或者低的CTCs的捕获效率差别不大，捕获效率超过60%，纯度大约50%。用癌症患者和健康人体的血液样品经过CTCs-chip检测，从116个患者中的115个患者身上检测到了CTCs，而20个健康人体没有检测到CTCs，敏感性达到了99.1%，特异性为100%。同时，检测到的CTCs数目与病人的病情相关[13]。
一种类似的微柱是在”geometrically enhanced differential immunocapture”微芯片上连接前列腺特异性膜抗原(PSMA)，这种微芯片的捕获效率为85%，纯度为68%，并且从20个前列腺病人中的18个检测到了CTCs[14]。
最近，Ozkumur等开发了”CTC-iChip”，该装置可以用于以阳性EpCAM抗体的CTCs 筛选，也可以用于以大小为基础的富集步骤后对白细胞的消除。据报道，他们的捕获效率达到了98.6%，纯度为0.02-42%。CONG 42个转移性癌症病人中的37个身上检测出了CTCs，而Cell Research仅从29个病人身上检测到CTCs[15]。
Fig 2 CTC-chip 富集检测CTCs流程
1.1.3纳米结构底物(Nanostructured substrate)
Wang等利用纳米结构底物，以非常高的接触比表面积进行免疫亲和，用EpCAM抗体结合纳米柱，获得捕获效率95%，通量为1ml/h。用这个方法从26个前列腺癌中的20个病人身上检测到了CTCs[16]。该芯片又被进一步修饰为以静电聚合物纳米纤维为底物，并与激光捕获显微切割联用，分离单个前列腺癌症CTCs，然后可用于扩增或全基因组测序[17]。
Fig 3 纳米结构底物富集CTCs流程
1.1.4微纤维(Microtubes)
Hughes等用仿生的方法模拟血管选择素接到的细胞粘附过程进行CTCs捕获。选择素包被的围观外观？诱导细胞附着和卷曲，促进CTCs与抗EpV AMEpCAM抗体和PSMA抗体，在4.8ml/h，这个装置的捕获效率为50%，纯度为66%，并且从14个测试病人的血样中全部能够检测到CTCs，而Cell Search中质中只检测到9个[18]。
1.1.5 体内采样(In vivo sampling)
Saucedo-Zeni等开发了一种体内采样的方法，将医学导线与EpCAM抗体连接，医疗导线通过插管注射到患者静脉30分钟，以润徐允许大体积的血液(1.5-3L)直接连续采样。这个方法成功的在24个乳腺癌或者肺癌病人中的22个病人身上腹肌富集到了CTCs[19]。
1.1.6白细胞消除(Leukocyte depletion)
使用白细胞抗原(如CD45，CD14等)的单克隆抗体，以减少造血起源的细胞。一些策略包
括抗体标记白细胞标记，通过免疫磁珠分离去除白细胞，这些方法都能够有很好的恢复率和对CTCs的最小干扰，但可能降低样品的纯度[20]。
1.1.7 小结
抗原-抗体反应的特异性是使CTCs的分离具有非常高水平的特异性。然而，CTCs的富集结果将严重依赖于所实用使用的特定抗体的性能。目前还有没已知的理想CTCs抗原靶，点可已可以将所有的CTCs捕获而对所有的造血细胞排斥。最近的报告表明，抗EpCAM的方法可能错过不表现上皮表型的CTCs，这可能由于EMT和EpCAM在一些上皮细胞CTCs 的可变表达[21]。使用鸡尾酒式的抗体组合，可能会增加捕获效率，但也可能会降低特异性和样品的纯度。白细胞消除方法的好处是在分离过程中不会干扰CTCs的表型，但也可能会使附着在白细胞或者与白细胞相互作用的CTCs丢失。白细胞消除法会导致CTCs的纯度比阳性免疫亲和方法获得的CTCs纯度降低。一般来讲，免疫亲和方法需要长时间的孵育和反应时间，来富集更多地CTCs，这也可能成为加快速度的瓶颈。对于用阳性筛选的免疫亲和方法而言，将CTCs从免疫亲和标签上分开也可能是个挑战。惊天霹雳
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