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本法系将供试品或供试品液接触细胞，通过对细胞形态、增殖和抑制影响的观察，评价供试品对体外细胞的毒性作用。 试验用细胞推荐使用小鼠成纤维细胞L-929。试验时采用传代48～72h生长旺盛的细 新密市人事劳动局
1 相对增殖度法
阳性对照液制备取生物毒性阳性参比物质，照供试品制备项下的规定进行，如6.3%苯酚的细胞培养液。
检查法取33个培养瓶，分别加入4×104个/ml浓度细胞悬液1ml，细胞培养液4ml，置(37±1)℃，（5±1）%CO2的条件下培养24h。培养24h后弃去原培养液。
阴性对照组：取13个培养瓶加入5ml阴性对照液；阳性对照组取10个培养瓶加入5ml
根据各组细胞浓度按下式计算细胞相对增殖度（RGR）：
100⨯=均值
阴性对照组细胞浓度平组）细胞浓度平均值供试品组（或阳性对照RGR 结果评价 试验组相对增殖度（以第7天的细胞浓度计算）为0级或1级判为合格。试
验组相对增殖度为2级，应结合形态综合评价，轻微毒或无毒的判为合格。试验组相对增殖度为3级～5级判为不合格。
2 琼脂扩散法
供试品制备 将样品用纯化水冲洗干净（根据实际情况需要），用滤纸吸干。
若用供试品液进行试验，将制备的供试品液附着到生物惰性吸收性的基质﹙例如超细硼
硅玻璃纤维滤纸﹚上，制成面积不少于100mm 2的圆形供试品。
阴性对照制备 取无生物毒性阴性参比物质，例如高密度聚乙烯。按照供试品制备项下
包一峰的规定进行。
阳性对照制备 取生物毒性阳性参比物质，例如含二乙基二硫代氨基甲酸锌的聚氨酯
（ZDEC ）。按照供试品制备项下的规定进行。可采用10%二甲基亚砜(DMSO)溶液，附着到生物惰性吸收性（例如超细硼硅玻璃纤维滤纸）的基质上。
夜尿停qq空间登录网站检查法
取细胞悬浮液（1×105个/ml ）7ml ，均匀分散至直径60mm 的培养皿中。置于含（5±1）%CO 2
气体的细胞培养箱中培养24h 至近汇合单层细胞，弃去培养皿中培养基，将溶化琼脂冷却至48℃左右与含20%血清的2倍新鲜哺乳动物细胞培养基混合，使琼脂最终质量浓度不大于2%，在每只培养皿内加入新制备的含琼脂培养基（要足够薄以利于可沥滤物的扩散）。
含琼脂培养基凝固后，可用适当的染方法染。将供试品、阴性对照、阳性对照小心
地放在培养皿的固化琼脂层表面。
每个供试品、阴性对照、阳性对照试样间尽量保持合适的距离并远离培养皿壁，每一培
养皿中放置不超过3个试样，每个试样至少设置2个平行。置(37±1)℃含（5±1）% CO 2的细胞培养箱
中至少培养(24±2)h 。培养箱宜保持适当的湿度。用显微镜观察每个供试品、阴性对照、阳性对照试样反应区域。用活体染料如中性红可有助于检测细胞毒性。
结果评价
按表5进行细胞毒性评价和分级。如阴性对照为0级（无毒）、阳性对照不小于3级（中
度毒），则细胞培养试验系统有效。
可靠性
表5琼脂扩散试验的毒性分级
检测提取液时，供试品液的反应区域应减去介质对照的反应区域，再进行毒性分级。供试品和/或供试品液细胞毒性分级不大于2级（轻度毒）以上时，则判为合格。
3 直接接触法
郎咸白供试品制备采用供试品的平整部分，表面积不小于100mm2。
阴性对照制备取高密度聚乙烯参比物质，照供试品制备项下的规定进行。
阳性对照制备取生物毒性阳性参比物质，照供试品制备项下的规定进行。
检查法取生长旺盛的细胞悬浮液（1×105个/ml）2ml，置直径35mm的平皿中培养单层细胞。置于细胞培养箱中培养24h至近汇合单层细胞，吸去培养基，替换为0.8ml
的新鲜培养基。
在每个培养皿中单独放置1个供试品、阳性对照或阴性对照，每个试样至少设置
2个平行。将所有的培养物置(37±1)℃含（5±1）% CO2的细胞培养箱中至少培养24h，培养箱宜保持适当的湿度。显微镜下观察每个供试品、阴性对照、阳性对照周围，必要时应进行染。
结果评价按照琼脂扩散法结果评价项下的规定进行。若样品不超过2级（轻微毒），则样品判为合格。若试验系统无效需重复试验过程。
4 提取法
阴性对照制备取高密度聚乙烯参比物质，照供试品溶液制备项下的规定进行。
阳性对照制备取生物毒性阳性参比物质，照供试品溶液制备项下的规定进行。
检查法取生长旺盛的细胞悬浮液（1×105个/ml）2ml，置直径35mm的平皿中培养单层细胞。培养不少于24h细胞至少达到80%近汇合后，吸去培养基，替换为供试品液、阴性对照液或阳性对照液。含血清培养基提取液和不含血清培养基提取液无需稀释，平行试验2份。0.9%氯化钠注射液为介质的提取液用含血清的细胞培养基稀释至提取液浓度为25%，平行试验2份。所有的培养物在（37±1）℃，增湿且含（5±1）%CO2的培养箱中培养48h。48h后，在显微镜下观察培养物，如有必要，进行染。
结果评价按表6进行毒性评价和分级。若试验系统不成立，重复试验。供试品不超过2级（轻微毒），则判为合格。如需进行剂量-反应程度评价，可通过定量稀释供试品液，重复试验。
表6 提取法毒性分级
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