细胞自噬检测

2.5细胞裂解

细胞从培养皿上被刮下来之后,在15ml灭菌塑料试管中用PBS洗涤3次,每次洗涤用10mlPBs充分重悬细胞,在4“c下5009离心5min;所有操作在冰上进行;最后一步洗涤把细胞转移到1.smlePpendorf管中;把细胞充分重悬在TAP细胞裂解液中;根据细胞量决定裂解缓冲液的体积一般每10川细胞用100川一200川TAPBu价r;放置于冰上30min,每10min用移液吹打细胞一次使之充分悬浮;在4OC下用100009高速离心15min,把上清转移到新的试管中进行下一步实验,丢弃沉淀;

2.13细胞自噬活性的检测

我们主要通过两条途径来诱导细胞发生自噬,一饥饿处理,二药物RaPamycin处理;对

于饥饿处理,吸去正常培养的细胞中的培养液,用PBS小心洗涤细胞三次,注意不要使细

胞脱离培养皿,加入15mlEBss用量根据培养皿的大小而定连同2林M的ED64和pePstatin;

在37“C培养箱中培养2一4h;对于RaPamycin处理,在普通细胞培养液中加入终浓度为

500nM的R叩amyeinsigma37“e下培养12h;细胞自噬活性的检测主要有两条途径,一

关于加快推进生态文明建设的意见

风雨张居正下载条是通过转染GFP一LC3,再用荧光显微镜观察LC3在细胞质中的聚集;二是用westemblotting和LC3的抗体,检测细胞内源LC3n的增加;对于荧光显微镜分析,在U20S细胞中转染GFP一LC3,24h之后,把细胞继代培养在有盖玻片的6孔板中,诱导自噬,吸去培养液,用PBS小心润洗玻片1次,在每个孔内加入3%的多聚甲醛,在室温下闭光摇晃培养玻片20min;用PBS洗涤玻片3次,每次每孔加2mlPBS在室温下摇晃10min,用固定液把盖玻片固定在载玻片上,在室温下干燥1min之后用荧光显微镜观察;对于westemblotting,从培养皿上收集药物或饥饿处理之后的细胞,加入1‘SDS蛋白上样缓冲液,并用超声波处理直到不粘稠为止,95“e煮沸样品5min,室温下高速100009离心5min,通过SDs一pAGE并用LC3的抗体sigma进行westemblotting检测,自噬活性越高的细胞内LC3n的条带浓度越高;

　1.2.1 自噬体检测

实验分为3组, 分别为自噬诱导组, 自噬抑制组和雷帕霉素组;自噬诱导组: 1×105 RAW264.7细胞培养至对数生长期, 加入50 nmol/L雷帕霉素作用3h, 然后按感染复数MOI=1∶10比例加入1×109 CFU/L的H37Rv菌株培养3h, PBSpH7.4缓冲液洗脱3次以洗脱未

结合的H37Rv菌株;自噬抑制组: RAW264.7细胞加入自噬抑制剂3MA600 mg/L作用36 h, 然后按MOI=1∶10比例接种H37Rv菌株作用3h;雷帕霉素组: RAW264.7细胞培养至对数生长期, 加入50 nmol/L雷帕霉素作用3h;上述各组细胞胰酶消化后收集, 20 g/L锇酸固定过夜, 透射电镜观察自噬体的形成;

1.2.2 菌落形成单位CFU检测

自噬诱导组和自噬抑制组细胞胰酶消化后收集, 加入2倍体积双蒸水裂解细胞, 7 000 r/min离心, 收集沉淀, 重悬后1∶107稀释, 取100 μL悬液接种于7H10培养基, 37℃培养21 d进行菌落计数;

锻压技术　2 结果

2.1 自噬体检测

雷帕霉素作用于RAW264.7细胞后, 以H37Rv菌株感染细胞, 透射电镜可发现细胞中有大量由单层膜组成的自噬囊泡出现, 同样雷帕霉素组也可诱导产生自噬体形成;而以自噬抑制剂3 MA处理RAW264.7后, 细胞中未发现自噬囊泡图1;

2.2 CFU检测

H37Rv菌株感染细胞后裂解, 稀释后接种于7H10培养基, 经过21 d培养, 计数CFU;自噬诱导组H37Rv菌株CFU为4.12±0.32, 而3MA处理后CFU为6.43±0.11, 两组相比有统计学意义P<0.05;这些结果说明自噬体产生后可对胞内感染的H37Rv菌株有一定的清除作用;

1．3免疫荧光法观察长春瑞滨给药后A549细胞内LC3蛋白表达的变化A549细胞接种于多聚赖氨酸处理的盖玻片于6孔板中,待细胞贴壁后加入一定浓度的长春瑞滨同时设立阴性对照和空白对照,培养不同时间O一24h后,于盖玻片上4％多聚甲醛固定细胞15 min,固定的细胞用PBS洗两次后,加入0．25％Triton—X100冰上放置5 min,PBS洗2次,然后加入1％牛血清白蛋白bovine serum albumin,BSA处理30 min,加入I％BSA稀释的羊抗人MAPl一LC3一II1：200,4 oC孵育过夜,次日用PBS洗3次后,加LFITC标记的兔抗羊IgG1％BSA以l：20的比例稀释,室温下避光孵育30 min,PBS再次洗涤细胞后,用lO¨g／mL PI和Rnase A室温下细胞核DNA染30rain,激光共聚焦显微镜下观察;

1．4 LC3免疫荧光染后流式细胞仪对细胞自噬进行定量检测按上述1．3方法收集细胞同时设立空白对照及阴性对照组后用4℃预冷的PBS洗2遍,然后用4％不含甲醇的甲醛冰上固

李宝健定细胞2次后,PBS洗2次,80％冰乙醇固定,置一20℃冰箱过夜,固定的细胞用PBS洗2次,然后加入I％BSAl00 IX L重悬细胞,加入I％BSA稀释的兔抗人MAP—LC3一II1：100,4 oC孵育过夜;次Et细胞用PBS洗3次后,加入F11'C标记的羊抗兔IgGI％BSA以1：20的比例稀释,室温下避光孵育30 min,PBS再次洗涤细胞,流式细胞仪检测LC3荧光水平的变化,反应自噬的比率;

平衡盐溶液配制

平衡盐溶液是由Ringer根据生理盐水首先创制的,由无机盐和添加成分葡萄糖等组成;平衡盐溶液是为了使哺乳动物细胞短期处于存活状态,而不是促进其生长;平衡盐溶液是用来洗涤组织和细胞,稀释作用于细胞的试剂和药物等,维持生理的pH和渗透压;

1．Hank's平衡盐溶液

Hank's平衡盐溶液是含磷酸盐的缓冲溶液,在暴露于空气的状态下,能够维持生理的pH;因此,经常作为酶消化细胞或组织和最终将细胞置于培养基中之前的洗涤细胞过程的首选溶液;

Hank's平衡盐溶液配方 Hank's Balanced Salt Solution HBSS

组分分子量浓度 gm/L 摩尔浓度 mMx抗体

无机盐：

氯化钾 KCl 75 0.4 5.33

磷酸二氢钾 KH2PO4 136 0.06 0.44

碳酸氢钠 NaHCO3 84 0.35 4

氯化钠 NaCl 58 8 138

磷酸氢二钠 Na2HPO4 142 0.048 0.34

其它组分：

葡萄糖 Glucose 180 1 5.6

酚红 Phenol Red 398 0.011 0.03

2．磷酸盐缓冲溶液

Dulbecco's 磷酸盐缓冲溶液配方 Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline D-PBS 不含钙、镁离子

组分分子量浓度 gm/L 摩尔浓度 mM蛇药片

氯化钾 KCl 75 0.20 2.67

磷酸二氢钾 KH2PO4 136 0.20 1.47

氯化钠 NaCl 58 8.00 138.00

磷酸氢二钠 Na2HPO4 142 1.15 8.10

本文发布于:2024-09-25 20:30:27，感谢您对本站的认可！

本文链接：https://www.17tex.com/xueshu/77681.html

上一篇：方法--流式细胞术检测细胞

下一篇：细胞毒性检查法

标签：细胞加入洗涤检测室温

留言与评论（共有 0 条评论）