(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010762580.3
(22)申请日 2020.08.01
(83)生物保藏信息
CCTCC NO: M 203078 2003.11.17
(71)申请人 武汉真福医药股份有限公司
地址 430206 湖北省武汉市东湖新技术开
发区高新二路388号武汉光谷国际生
物医药企业加速器17号楼1单元5层
(72)发明人 王业富 高雅 董艳山 肖帅
李靖
(74)专利代理机构 北京中济纬天专利代理有限
公司 11429
代理人 邓佳
(51)Int.Cl.
A61K 38/48(2006.01)
A61P 1/10(2006.01)C12N 9/54(2006.01)C12R 1/125(2006.01) (54)发明名称
的应用
(57)摘要
本发明公开了一种枯草杆菌纤溶酶在
功能性便秘药物中的应用。枯草杆菌纤溶酶由枯
草杆菌Bacillus subtilis
QK02菌种发酵制得，该菌种己保存于国家典型培养物保藏中心，菌种
编号为CCTCCNO：M203078。本发明的枯草杆菌纤
溶酶对功能性便秘具有很好的效果，能有效
节肠道酶活性对便秘起改善作用，其可以在
功能性便秘药物中广泛应用。本发明的枯草杆菌
纤溶酶相比于现有的功能性便秘的临床药
物，使用后毒副作用小，
更安全。权利要求书1页 说明书4页CN 112089829 A 2020.12.18
C N 112089829
A
1.枯草杆菌纤溶酶在功能性便秘药物中的应用。
2.如权利要求1所述的枯草杆菌纤溶酶在功能性便秘药物中的应用，其特征在于，所述枯草杆菌纤溶酶由枯草杆菌Bacillus subtilis QK02菌种发酵制得，该菌种己保存于国家典型培养物保藏中心，菌种编号为CCTCCNO：M203078。
3.如权利要求2所述的枯草杆菌纤溶酶在功能性便秘药物中的应用，其特征在于，所述枯草杆菌纤溶酶采用以下方法制备：将枯草杆菌菌种用新鲜的斜面活化18h～24h，从斜面上取一环菌体接入装有LB液体培养基的三角瓶中，并于37℃、200r/min摇床振荡培养18h；将培养好的菌种按1wt％接种到发酵罐中发酵24h，控制发酵罐内温度37℃、湿度85％、溶氧
4.0mg/L～6.0mg/L；发酵液经过离心、微滤、超滤浓缩后，喷雾干燥即得所述枯草杆菌纤溶酶；发酵罐中含有以下营养成分：蛋白胨2％、葡萄糖2％、磷酸氢二钠1％、磷酸二氢钠0.1％、硫酸镁0.05％、无水氯化钙0.02％、消泡剂0.1％、余量为水。
4.如权利要求1所述的枯草杆菌纤溶酶在功能性便秘药物中的应用，其特征在于，所述枯草杆菌纤溶酶可与医药学上可接受的辅料配合制成粉剂、胶囊剂或者片剂。
权 利 要 求 书1/1页CN 112089829 A
枯草杆菌纤溶酶在功能性便秘药物中的应用
技术领域
[0001]本发明涉及功能性便秘技术领域，尤其是，本发明涉及枯草杆菌纤溶酶在功能性便秘药物中的应用。
背景技术
[0002]便秘是一种常见的慢性胃肠疾病，粪便干硬、排便困难或者每周排便次数少于三次即视为便秘。食物在消化道经消化吸收，剩余的食糜残渣从小肠输送到结肠，结肠内再将大部分的水分和电解质吸收形成粪团，最后输送至乙状结肠以及直肠，通过一系列的排便活动，将粪便排出体外。从形成粪团到产生便意和排便动作的各个环节，均可以因神经系统活动异常，肠平滑肌病变以及肛门括约肌功能异常或病变而发生便秘。
[0003]便秘可以分为器质性便秘和功能性便秘(FC)，功能性便秘主要由于肠功能紊乱引起，是无明显器质性病变或继发于代谢病、系统性疾病或药物因素而功能性排便困难为特征的便秘。FC又可以分为慢传输性便秘(STC)和出口梗阻性便秘以及混合型便秘，其中慢传输性便秘相对来说是最普遍的一种症状。造成慢传输型便秘的原因有很多，包括膳食纤维和液体摄入量不足，不良饮食习惯以及缺乏锻炼等因素。流行病学研究显示，我国便秘发病率有5％～6％，在老年人甚至可达到15％～20％，并且有逐年增加的趋势。
[0004]目前便秘药物种类有容积性泻剂、盐类泻剂、渗透性泻剂、刺激性泻剂、促动力剂、润滑剂等。常见盐类泻剂、刺激性泻剂如硫酸镁、镁乳、含蒽醌类的植物性泻药(大黄、弗朗鼠李皮、番泻叶、芦荟)、酚酞、蓖麻油、双酯酚汀等，这些药物作用比较明显，但长期服用可引起严重不良反应，加重便秘，停药后可逆。
[0005]肠道微生态结构是便秘发生机制的重要因素之一。肠道及肠道菌通过产生各种酶，去调节肠道蠕动，肠道酶活性在便秘过程中具有重要的作用。因此，研究在疾病控制和预防方面效果好、毒副作用小的具有通便作用的生物活性物质，通过改善肠道微生态结构，功能性便秘的药物具有重要意义。
发明内容
[0006]为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供枯草杆菌纤溶酶在功能性便秘药物中的应用。
[0007]优选地，所述枯草杆菌纤溶酶由枯草杆菌Bacillus subtilis QK02菌种发酵制得，该菌种己保存于国家典型培养物保藏中心，位于湖北武汉，菌种编号为 CCTCCNO：M203078，保藏日期为2003年11月17日。
[0008]优选地，所述枯草杆菌纤溶酶采用以下方法制备：将枯草杆菌菌种用新鲜的斜面活化18h～24h，从斜面上取一环菌体接入装有LB液体培养基的三角瓶中，并于37℃、200r/ min摇床振荡培养18h；将培养好的菌种按1wt％接种到发酵罐中发酵24h，控制发酵罐内温度37℃、湿度85％、溶氧4.0mg/L～6.0mg/L；发酵液经过离心、微滤、超滤浓缩后，喷雾干燥即得所述枯草杆菌纤溶酶；发酵罐中含有以下营养成分：蛋白胨2％、葡萄糖2％、磷酸氢二
钠1％、磷酸二氢钠0.1％、硫酸镁0.05％、无水氯化钙0.02％、消泡剂0.1％、余量为水。[0009]优选地，所述枯草杆菌纤溶酶可与医药学上可接受的辅料配合制成粉剂、胶囊剂或者片剂。
[0010]与现有技术相比，本发明的技术效果体现在：
[0011]本发明的枯草杆菌纤溶酶对功能性便秘具有很好的效果，能有效提高大便含水量，有助于肠道蠕动，并可通过调节肠道酶活性对便秘起改善作用，其可以在功能性便秘药物中广泛应用。本发明的枯草杆菌纤溶酶相比于现有的功能性便秘的临床药物，使用后毒副作用小，更安全。
具体实施方式
[0012]以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0013]须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。
[0014]此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发
明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
[0015]实施例1
[0016]本发明实施例1提供一种制备枯草杆菌纤溶酶粉的制备方法，具体如下：[0017](1)将置于-80℃低温冰箱里保存的枯草杆菌菌种取出后用新鲜的斜面活化 18h ～24h，从斜面上取一环菌体接入装有LB液体培养基的三角瓶中，并于37℃、 200r/min摇床振荡培养18h。
[0018](2)配制发酵罐培养基300L，培养基中含有以下质量百分比营养成分：蛋白胨2％、葡萄糖2％、磷酸氢二钠1％、磷酸二氢钠0.1％、硫酸镁0.05％、无水氯化钙0.02％、消泡剂0.1％、余量为水。
[0019](3)将配制好的发酵罐培养基在115℃下灭菌处理30min，冷却至室温后，将步骤(1)中培养好的菌种按1wt％接种到发酵罐中发酵24h，控制发酵罐内温度37℃、湿度85％、溶氧4.0mg/L～6.0mg/L；发酵液经过离心、微滤、超滤浓缩后，喷雾干燥即得枯草杆菌纤溶酶。喷雾干燥的进风温度140℃、出风温度为63℃-68℃。
[0020]实施例2
[0021]本发明实施例2提供一种枯草杆菌纤溶酶在对大鼠功能性便秘的上的应用。[0022]模型的建立： 连续2周，每天以复方地芬诺酯混悬液对大鼠进行灌胃，剂量为2ml/ 100g。正常进食饮水。2周内密切观测大鼠体重、精神状态及排便情况。与正常大鼠相比，质量降低、精神状态差、大便粒数少、粪质干硬即为模型建立成功。
[0023]动物分组及给药方法：根据质量随机分成3组，空白对照组、以前述得到的便秘大
鼠为模型组和给药组，每组20只，雌雄各半，饲养环境符合SPF级实验条件要求。空白对照组、模型组正常进食饮水，不做处理。给药组正常进食饮水外每日经口给予枯草杆菌纤溶酶粉，剂量为100IU/100g。上述方案连续喂养2 周后。测量大便含水量(大便含水量＝[(湿重－干重)/湿重]×100％)、大鼠肠道碳末推进率(炭末推进率(％)＝[幽门至活性炭悬液末端的长度(cm)/肠道总长度(cm)]×100％)、大鼠肠道酶活性。枯草杆菌纤溶酶粉对大鼠大便含水量的影响结果如表1所示。枯草杆菌纤溶酶粉对大鼠肠道碳末推进率的影响结果如表2所示。枯草杆菌纤溶酶粉对大鼠肠道酶活性的影响结果如表3所示。
[0024]表1不同处理组大鼠大便含水量比较(n＝20)
[0025]组别造模前造模后给药1周给药2周对照组64.77±8.6566.43±7.6965.96±8.3264.23±8.59
模型组63.98±9.2836.69±5.62&&35.68±5.0534.58±4.76
给药组64.83±8.4537.32±4.68&&45.94±6.52*56.58±7.21** [0026]注：与对照组相比，&&p＜0.01；与模
型组相比，*p＜0.05，**p＜0.01。
[0027]从表1看到，给药1周后，给药组能增加大鼠大便含水量，且随着给药时间的增加，2周后给药组大鼠大便含水量进一步增加且与模型组相比有明显提高，但尚未完恢复到正常含水量。表明枯草杆菌纤溶酶粉能有效提高大鼠大便含水量。
[0028]表2不同处理组大鼠肠道碳末推进率比较(n＝5)
[0029]组别碳末推进长度(cm)肠道总长度(cm)肠道推进率(％)对照组67.58±6.43103.26±4.3565.45±6.76
模型组38.75±4.33&&102.54±4.6237.79±7.25&&
给药组56.74±4.86**101.66±5.2255.81±6.84** [0030]注：与对照组相比，&&p＜0.01；与模型组相比，**p＜0.01。
[0031]从表2看到，2周后，给药组大鼠肠道碳末推进长度及肠道推进率均明显优于模型组，有显著差异(p＜0.01)。可知，枯草杆菌纤溶酶粉有利于肠道蠕动，改善便秘。[0032]表3不同处理组大鼠肠道酶活性比较(n＝15)
[0033]组别蛋白酶(U/mg)淀粉酶(U/mg)纤维素酶(U/mg)脂肪酶(U/mg)对照组69.21±11.398.53±1.61 4.71±0.4887.74±13.25
模型组54.56±13.87 5.42±1.36 2.83±0.5671.59±10.75
给药组83.63±9.55**7.61±1.78 3.56±0.68105.61±12.47** [0034]注：与模型组相比，**p＜0.01。
[0035]从表3看到，模型组较正常组大鼠肠道蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶活力降低但并无显著降低。经过2周的给药，与模型组相比，给药组大鼠蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性有提升，且蛋白酶和脂肪酶活性提高显著(**p＜0.01)。相反，对便秘大鼠，枯草杆菌纤溶酶粉对纤维素酶活性有提高，但不显著的影响不明显。说明枯草杆菌纤溶酶粉可通过调节肠道酶活性对便秘起改善作用。
[0036]实施例3
[0037]本发明实施例3提供一种枯草杆菌纤溶酶在对家兔功能性便秘的上的应用。[0038]模型的建立：连续4周，每天以复方地芬诺酯混悬液对健康家兔进行灌胃，剂量为
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