(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011188974.9
(22)申请日 2020.10.30
(71)申请人 润辉生物技术（威海）有限公司
地址 264200 山东省威海市南海新区阳光
路南、龙海路东
(72)发明人 姬胜利 殷金岗 杨燕 郭凯
(74)专利代理机构 威海恒誉润达专利代理事务
所(普通合伙) 37260
代理人 王丽英
(51)Int.Cl.
A61K 8/60(2006.01)
A61Q 19/00(2006.01)
A61K 31/711(2006.01)
A61P 17/02(2006.01)
C07H 21/04(2006.01)
C07H 1/08(2006.01)C12P 19/34(2006.01)
(54)发明名称一种高效的外用PDRN的制备方法及其应用(57)摘要本发明涉及一种高效的外用PDRN的制备方法及其应用，解决了现有技术PDRN的提取收率低，在较高温度下使用酸降解DNA降低分子量的过程中需高温反应条件、加碱中和、超声波分解破碎过程中产生局部高温，易发生美拉德反应，导致产品颜发黄，影响产品质量，并且在降解过程中不易控制产品分子量的分布范围等问题，用胰酶对鱼精巢细胞进行裂解，用SDS/NaCl溶液离心沉淀蛋白，添加无水乙醇对DNA进行沉淀、冻干得到大分子的DN A；再使用限制性内切酶Sau3 AI和/或脱氧核糖核酸酶对DNA进行降解，获得PDRN。本发明在温和的反应条件下以较高的收率将PDRN限制在小于10kD的范围内，提高了产品质量、
降低了生产成本。权利要求书1页 说明书11页 附图1页CN 112315836 A 2021.02.05
C N 112315836
A
1.一种高效的外用PDRN的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤1，鱼精巢预处理；
步骤2，鱼精细胞收集；
步骤3，酶解鱼精细胞中的鱼精蛋白；
步骤4，SDS除鱼精蛋白，离心获得含鱼精巢DNA上清液；
步骤5，乙醇沉淀获得鱼精巢DNA；
步骤6，酶切鱼精巢DNA获取PDRN。
2.根据权利要求1所述的高效的外用PDRN的制备方法，其特征在于：所述步骤2中的鱼精巢经过混合盐溶液处理，所述混合盐采用氯化钠、柠檬酸钠、亚硫酸钠的混合盐。
3.根据权利要求1所述的高效的外用PDRN的制备方法，其特征在于：所述步骤3中的酶解所用的酶是胰酶、枯草杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、蛋白酶K中的一种。
4.根据权利要求1所述的高效的外用PDRN的制备方法，其特征在于：所述步骤6中的酶切过程中的酶为限制性内切酶Sau3 AI和/或脱氧核糖核酸酶。
5.一种外用PDRN的应用，其特征在于：权利要求1-4任意一项所述的PDRN用于外用美容产品和整形医美产品。
权 利 要 求 书1/1页CN 112315836 A
一种高效的外用PDRN的制备方法及其应用
技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效的外用PDRN的制备 方法及其应用。
背景技术
[0002]PDRN(Polydeoxyribonucleotide)，多聚脱氧核糖核苷酸，是大分子 DNA降解后的小片段的产物。自1952年Mastelli公司首次对PDRN的药 理活性进行研究以来，PDRN能够加速DNA的合成，作为皮肤天然的保 护剂和修复剂，具有的防晒、消炎、促进细胞再生、组织修复、促进伤 口愈合、减少疤痕生成、祛皱等美容修复功效逐渐被人熟知，被广泛用 于美容产品中。例如，Placentex-PDRN具有伤口、骨骼软组织再生 的功效。PDRN能够缩短皮肤代谢周期，使皮肤回到白嫩、光滑、富有 弹性的婴儿皮肤状态，PDRN婴儿针现已成为女性美容市场的火热产品， 普丽兰婴儿针的分子量为700kD，属于医疗器械级别的大分子物质，适 用于皮肤再生。
[0003]鱼类的精巢是产生精子和贮存精子的器官，其中含有大量DNA，是制备 PDRN的主要原料来源。研究表明对于外用的PDRN在分子量小于10kD的 范围内有最好的透皮吸收效果。DNA限制性内切酶是能识别并切割特异的双 链DNA序列的一种内切核酸酶，DNA限制性
内切酶Sau3 AI的识别位点 为假设A、T、C、G四种剪辑在DNA中随机分布，则理论
上酶44/256 个碱基就会出现一个Sau3 AI的酶切位点，因此如果酶切时间足够长，Sau3 AI 在理论上能够将DNA切成完全是256bp的多聚核苷酸片段。脱氧核糖核酸酶 能够水解DNA磷酸二酯键产生单脱氧核
苷酸或寡脱氧核苷酸的酶。
[0004]专利KR100986603公开了一种PDRN的制备方法，产率为7％。该 方法需要在不锈钢高压反应釜内加热至100-109℃条件高温灭菌，如此的 反应条件在工业生产过程中危险性大，设备投入大；同时在68-72℃加醋 酸/盐酸混合液对DNA进行酸解降低分子量，再用添加32％NaOH溶液 调pH至中性，在此条件下易发生美拉德反应，导致产品颜发黄，影响 产品质量。专利CN106031709B公开了一种PDRN的制备方法，该方法 得到的产品中蛋白含量较高为2.5-5％，产品收率为3-7％，并且并未提及 DNA的分子量大小及分布区间。专利CN107287186A公开了一种PDRN 的制备方法，该方法需将鱼精液在-80℃下进行冻融，通过超声波分解仪 破碎DNA，然而超声波分解破碎DNA的方法主要适用于实验室规模， 在大规模工业生产中不易控制产品的分子量，破碎过程中产生局部高温， 易发生美拉德反应，导致产品颜发黄，影响产品质量，影响在大规模 工业生产中的应用。专利CN110747194A公开了一种PDRN的制备方法， 需要在90-100℃条件下对精巢组织进行裂解，DNA打断仪分解仪破碎 DNA也易产热、导致美拉德反应，在大规模工业生产中不易操作。综上 所述，现有技术PDRN的提取收率低，在较高温度下使用酸降解DNA降 低分子量的过程中需高温反应条件、加碱中和、超声波分解破碎过程中 产生局部高温，易发生美拉德反应，导致产品颜发黄，影响产品质量， 并且在降解过程中不易控制产品分子量的分布范围，大分子的PDRN不 易被皮肤吸收。
发明内容
[0005]针对现有技术中的问题，本发明提供一种高效的外用PDRN的制备 方法及其应用，解决了现有PDRN的提取率低，易发生美拉德反应的问 题，利用限制性内切酶Sau3 AI和核糖核酸酶对DNA进行降解，控制反 应时间在温和的反应条件下有效的避免了美拉德反应，将PDRN限制在 小于10kD的范围内，利于皮肤吸收。
[0006]为实现以上技术目的，本发明的技术方案是：
[0007]一种高效的外用PDRN的制备方法，包括如下步骤：
[0008]步骤1，鱼精巢预处理；
[0009]步骤2，鱼精细胞收集；
[0010]步骤3，酶解鱼精细胞中的鱼精蛋白；
[0011]步骤4，SDS除鱼精蛋白，离心获得含鱼精巢DNA上清液；
[0012]步骤5，乙醇沉淀获得鱼精巢DNA；
[0013]步骤6，酶切鱼精巢DNA获取PDRN。
[0014]所述步骤2中的鱼精巢经过混合盐溶液处理，所述混合盐采用氯化 钠、柠檬酸钠、亚硫酸钠的混合盐。
[0015]所述步骤3中的酶解所用的酶是胰酶、枯草杆菌蛋白酶、木瓜蛋白 酶、风味蛋白酶、蛋白酶K中的一种。
[0016]所述步骤6中的酶切过程中的酶为限制性内切酶Sau3 AI和/或脱氧 核糖核酸酶。[0017]优选的，步骤1，鱼精巢预处理：将冷库内冷冻保存的大马哈鱼鱼精 巢取出，于室温下解冻；再用去离子水洗涤两次；最后使用粉碎机对鱼 精巢进行粉碎处理，将鱼精巢彻底粉碎成浆糊状。
[0018]步骤2，鱼精细胞收集：
[0019](1)将步骤1得到的浆糊状处理物按照1:2(m/v)的比例加入至混合 盐溶液中，于室温搅拌5h，其中，混合盐溶液采用pH为8.0的0.15M NaCl/0.03M柠檬酸钠/0.5％NaHSO3的混合盐溶液；
[0020](2)将混合体系以4000rpm的转速离心15-30min，弃上清，再使用 pH 8.0的0.15M NaCl/0.03M柠檬酸钠的溶液将沉淀洗涤3-5次，离心获 得含鱼精细胞的沉淀物。
[0021]步骤3，酶解鱼精细胞中的鱼精蛋白：
[0022](1)在37℃下，将含鱼精细胞的沉淀物加入至0.15M NaCl/0.5mM EDTA的混合盐溶液中搅拌均匀，其中，沉淀物与混合盐的比例为1:25 (m/v)；
[0023](2)按照鱼精巢原料质量与胰蛋白酶质量为250:1的比例加入至反 应体系中，并在37℃下酶解18-24h。
[0024]步骤4，SDS除鱼精蛋白，离心获得含鱼精巢DNA上清液：
[0025]在步骤3中的反应体系中加入鱼精巢原料重量8-10％的SDS、最终 浓度为1.6M的NaCl，持续搅拌3-5h后离心沉淀，收集上清液。
[0026]步骤5，乙醇沉淀获得鱼精巢DNA：
[0027](1)将步骤4中的上清液按照2-2.5:1的体积比加入至预先冷却的无 水乙醇中搅拌，使絮状的DNA析出，并漂浮于溶液上层；
[0028](2)将上述的DNA取出，采用75％乙醇/H2O溶液洗涤、离心3-5次， 将得到的DNA沉
淀粉碎，经冻干处理得到白固体：DNA。
[0029]步骤6，酶切鱼精巢DNA获取PDRN：
[0030](1)鱼精巢DNA溶解：将步骤5中的DNA溶解在37℃的去离子 水中，形成10g/L的溶液；
[0031](2)限制性内切酶Sau3 AI酶解：将限制性内切酶Sau3 Al按照 500-5000U的酶量加入至上述37℃溶液中反应16-48h；
[0032](3)除蛋白：加入8-10％的SDS(w/v)、终浓度为1.6M的NaCl溶 液，继续搅拌3-5h后离心除沉淀，收集上清液；
[0033](4)鱼精巢DNA提取：上清液按照体积比为2-2.5:1的比例加至预 冷的无水乙醇中搅拌0.5-1h，将溶液以6000rpm的转速离心1h，弃上清； 用75％乙醇/H2O溶液将沉淀洗涤、离心3-5次后，将得到的DNA沉淀粉 碎，进行冻干得到白固体。
[0034]优选的，步骤6使用脱氧核糖核酸酶酶切鱼精巢DNA获取PDRN：
[0035](1)鱼精巢DNA溶解：将步骤5中的DNA溶解在37℃的去离子 水中，形成10g/L的溶液；
[0036](2)脱氧核糖核酸酶酶解：将脱氧核糖核酸酶加入至反应体系中形 成50-150mg/L 浓度，并在37℃下反应5-10h；
[0037](3)除蛋白：加入8-10％的SDS(w/v)、终浓度为1.6M的NaCl溶 液，继续搅拌3-5h后离心除沉淀，收集上清液；
[0038](4)鱼精巢DNA提取：上清液按照体积比为2-2.5:1的比例加至预 冷的无水乙醇中搅拌0.5-1h，将溶液以6000rpm的转速离心1h，弃上清； 用75％乙醇/H2O溶液将沉淀洗涤、离心3-5次后，将得到的DNA沉淀粉 碎，进行冻干得到白固体。
[0039]优选的，步骤6联合使用限制性内切酶Sau3 AI和脱氧核糖核酸酶酶 切鱼精巢DNA 获取PDRN：
[0040](1)鱼精巢DNA溶解：将步骤5中的DNA溶解在37℃的去离子 水中，形成10g/L的溶液；
[0041](2)限制性内切酶Sau3 AI酶解：将限制性内切酶Sau3 Al按照 500-5000U的酶量加入至上述37℃溶液中反应16-48h；
[0042](3)脱氧核糖核酸酶酶解：将脱氧核糖核酸酶加入至反应体系中形 成1-30mg/L浓度，并在37℃下反应0.5-2h；
[0043](4)除蛋白：加入8-10％的SDS(w/v)、终浓度为1.6M的NaCl溶 液，继续搅拌3-5h后离心除沉淀，收集上清液；
[0044](5)鱼精巢DNA提取：上清液按照体积比为2-2.5:1的比例加至预 冷的无水乙醇中搅拌0.5-1h，将溶液以6000rpm的转速离心1h，弃上清； 用75％乙醇/H2O溶液将沉淀洗涤、离心3-5次后，将得到的DNA沉淀粉 碎，进行冻干得到白固体。
[0045]所述PDRN可用于外用美容产品和整形医美产品。
[0046]本发明具有以下有益效果：
[0047] 1.本发明解决了现有PDRN的提取率低，已发生美拉德反应的问题， 利用限制性内切酶Sau3 AI和核糖核酸酶对DNA进行降解，控制反应时 间在温和的反应条件下有效的避免了美拉德反应，将PDRN限制在小于 10kD的范围内。
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