(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010225566.X
(22)申请日 2020.03.26
(71)申请人 吉林大学
地址 130012 吉林省长春市朝阳区前进大
街2699号
申请人 中关村三有利再生医学研究中心
(72)发明人 王立生 聂文博 赵丽晶 吴祖泽
(74)专利代理机构 北京劲创知识产权代理事务
所(普通合伙) 11589
代理人 张铁兰
(51)Int.Cl.
A61L 26/00(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一
种外泌体水凝胶伤口敷料及其制备方法。本发明
体和水凝胶，其中水凝胶由普朗尼克F127和普朗
尼克F68组成。分别配制普朗尼克F127和普朗尼
克F68的生理盐水溶液，及间充质干细胞外泌体
生理盐水重悬液，在4℃条件下将上述溶液混合，
即可得到外泌体水凝胶伤口敷料。实验结果表
明，相对于单独采用间充质干细胞外泌体和水凝
胶，本发明制备得到的伤口敷料更能促进皮肤创
面细胞再生，
缩短伤口愈合时间。权利要求书1页 说明书6页 附图2页CN 111437431 A 2020.07.24
C N 111437431
A
1.一种外泌体水凝胶伤口敷料，其特征在于：所述敷料包括间充质干细胞外泌体和水凝胶，所述水凝胶由普朗尼克F127和普朗尼克F68组成。
2.根据权利要求1所述的伤口敷料，其特征在于：普朗尼克F127在伤口敷料中的浓度为200-220mg/mL，普朗尼克F68在伤口敷料中的浓度为25-100mg/mL。
3.根据权利要求1所述的伤口敷料，其特征在于：所述间充质干细胞外泌体在伤口敷料中的浓度为100-200μg/mL。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的伤口敷料，其特征在于：间充质干细胞外泌体与水凝胶的体积比为1:1。
5.权利要求1-4任意一项外泌体水凝胶伤口敷料的制备方法，其特征在于，配制普朗尼克F127和普朗尼克F68的生理盐水溶液，得到A液；配制间充质干细胞外泌体生理盐水重悬液，得到B液；在4℃条件下将所述A液与所述B液混合，得到外泌体水凝胶伤口敷料。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述A液中，普朗尼克F127的浓度为400-440mg/mL，普朗尼克F68的浓度为50-200mg/mL。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述B液中，间充质干细胞外泌体的浓度为200-400μg/mL。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，所述A液与所述B液按体积比1:1混合。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞外泌体为从间充质干细胞培养基的上清液中提取得到。
10.根据根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述提取方法包括：所述上清液转移至50mL离心管中，在4℃环境中离心，转数500xg、离心5min，收上清；再转移至新的50mL 离心管中，在4℃环境中离心，转数2000xg，离心30min，收上清，与预冷的16％PEG 6000等体积混合，充分颠倒混匀，在4℃环境中静置过夜；在4℃环境中离心，转数10000xg、离心60min，倒出上清，加入50-100μL预冷的无菌PBS重悬，即为粗间充质干细胞外泌体，加入15-20mL预冷的无菌PBS，混匀，在4℃环境中离心，转数100000xg、离心70min，弃上清，加入200-400μL预冷的无菌PBS重悬，得到间充质干细胞外泌体。
权 利 要 求 书1/1页CN 111437431 A
一种外泌体水凝胶伤口敷料及其制备方法
技术领域
[0001]本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种外泌体水凝胶伤口敷料及其制备方法。
背景技术
[0002]据统计，我国超过2％的人经历着慢性创伤愈合的痛苦，全球每年用于伤口护理产品的费用高达150亿美元。传统伤口敷料如壳聚糖、透明质酸、藻酸盐和明胶等对慢性创面有一定的辅助作用，但伤口的愈合程度仍主要依赖患者的自身修复能力，造成大量慢性难治性伤口因患者营养状态差、高龄、免疫力低下等原因而长期迁延不愈甚至导致死亡。因此，迫切需要研制出基于临床伤口护理需求的具有组织再生功能的新型敷料。
[0003]间充质干细胞外泌体(MSC-exosome)具有与来源细胞相似的功能，而且对靶细胞的作用效率高、利于长期稳定保存和运输、使用浓度和剂量易于控制，同时可以克服间充质干细胞在体内存活率低及长期使用易突变致瘤的隐患。伤口敷料常常以水凝胶作为支架，承载有效成分，来达到治愈伤口的效果。但是传统水凝胶如壳聚糖、银离子敷料虽然其都具有较好的灭菌和抑菌的效果，但是都具有一定的毒性，对皮肤软组织具有一定伤害，影响伤口愈合的效果。另外，伤口敷料水凝胶普遍为胶状固态物质，
采用复杂的高成本的生物分子通过复杂的反应制备而成，一般需要进行交联，配置方法复杂，很容易出现水凝胶与有效成分混合不均、达不到缓释作用、影响有效成分效果的弊端，因此现有的水凝胶与内泌体制备得到的敷料仍然存在愈合时间短的缺点。
发明内容
[0004]本发明提供了一种外泌体水凝胶伤口敷料及其制备方法，能够显著促进创面细胞再生，缩短伤口愈合时间。
[0005]为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：
[0006]本发明提供了一种外泌体水凝胶伤口敷料，包括间充质干细胞细胞外泌体和水凝胶，其中水凝胶包括普朗尼克F127和普朗尼克F68。
[0007]优选的，普朗尼克F127在伤口敷料中的浓度为200-220mg/mL，普朗尼克F68在伤口敷料中的浓度为25-100mg/mL。
[0008]优选的，间充质干细胞外泌体在伤口敷料中的浓度为100-200μg/mL。
[0009]优选的，间充质干细胞外泌体与水凝胶的体积比为1:1。
[0010]本发明还提供了一种上述技术方案所述外泌体水凝胶伤口敷料的制备方法：配制普朗尼克F127和普朗尼克F68的生理盐水溶液，得到A液；配制间充质干细胞外泌体生理盐水重悬液，得到B液；在4℃条件下将所述A液与所述B液混合，得到外泌体水凝胶伤口敷料。[0011]优选的，在A液中，普朗尼克F127的浓度为400-440mg/mL，普朗尼克F68的浓度为50-200mg/mL。
[0012]优选的，在B液中，间充质干细胞外泌体的浓度为200-400μg/mL。
[0013]优选的，A液与B液按体积比1:1混合。
[0014]优选的，间充质干细胞外泌体为从间充质干细胞培养基的上清液中提取得到。[0015]优选的，上清液用PEG 60004℃静置过夜，离心后得到的沉淀用PBS重悬，得到间充质干细胞外泌体。
[0016]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0017]本发明的外泌体水凝胶伤口敷料包括间充质干细胞外泌体和水凝胶，所述水凝胶由普朗尼克F127和普朗尼克F68组成。其中间充质干细胞外泌体能促进成纤维细胞活化的胶原蛋白和弹性蛋白的分泌，诱导上皮细胞增殖和血管形成，促进皮肤创伤的再上皮化，防止肌纤维形成；由普朗尼克F127和普朗尼克F68制备得到的水凝胶可以为皮肤创伤提供湿润的微环境，吸收伤口渗出物，保护伤口不被感染，从而有加速创伤愈合的作用。本发明以水凝胶作为载药体系，搭载间充质干细胞外泌体，能够延长间充质
干细胞外泌体的局部作用时间，加强了水凝胶的促进创伤愈合的作用。实验结果表明，相对于单独采用间充质干细胞外泌体和水凝胶，本发明的伤口敷料更能促进皮肤创面细胞再生，缩短伤口愈合时间。[0018]本发明所采用的水凝胶作为复合组织工程支架材料，承载间充质干细胞外泌体。制备得到的外泌体水凝胶伤口敷料在低温下呈液态，使用时外敷于皮肤上呈凝胶状态，能提高敷料与伤口的接触面积，促进皮肤创伤愈合，是一种新型的伤口护理新材料。本发明的水凝胶无需复杂的高成本的生物分子，制备方法简单，并通过简单的化学官能团来引起复杂的细胞反应，是一种节约成本、无毒性的支架材料。
附图说明
[0019]图1是不同浓度普朗尼克F127对C2C12细胞存活的影响；
[0020]图2是不同浓度普朗尼克F68对C2C12细胞存活的影响；
[0021]图3是各时间点各组小鼠皮肤创面情况；
[0022]图4是各组皮肤创伤处理后不同时间点的创面面积。
具体实施方式
[0023]本发明提供了一种外泌体水凝胶伤口敷料，包括间充质干细胞外泌体和水凝胶，所述水凝胶由普朗尼克F127和普朗尼克F68组成。
[0024]在本发明中，间充质干细胞外泌体在伤口敷料组合物中的浓度为100-200μg/mL。间充质干细胞外泌体具有与来源细胞相似促进损伤的组织细胞再生的功能，更有利于促进皮肤创面的修复。
[0025]在本发明中，普朗尼克F127在伤口敷料组合物中的浓度为200-220mg/mL，普朗尼克F68在伤口敷料组合物中的浓度为25-100mg/mL。
[0026]普朗尼克为温敏性水凝胶，在低温状态下时为液态，在较高温度下时为固态，不同浓度的普朗尼克具有不同的相变温度。如果温敏性水凝胶的相变温度过高，则使水凝胶提前凝固，后期无法与外泌体充分混合，也无法与伤口创面充分接触，影响效果；若相变温度过低，则涂抹伤口后也不能成胶，呈液体状态易流失，起不到缓释作用。通过测定，普朗尼克F127与普朗尼克F68不同浓度混合物的相变温度，如下表1所示：
[0027]表1普朗尼克F127与普朗尼克F68不同浓度混合物与相变温度
[0028]
[0029]
[0030]可以从表1中看出，凝胶B3的相变温度为35.1℃、凝胶C1的相变温度为36.1℃，最接近伤口的温度，以保证外泌体水凝胶伤口敷料在制备过程中能与外泌体充分混合，在使用过程中能在伤口上凝固，起到缓释的作用。
[0031]本发明还提供了一种外泌体水凝胶伤口敷料的制备方法，包括以下步骤：配制浓度为400-440mg/mL普朗尼克F127和浓度为50-200mg/mL普朗尼克F68的生理盐水溶液，得到A液；配制浓度为200-400μg/mL的间充质干细胞外泌体生理盐水重悬液，得到B液；在4℃条件下将A液与所述B液混合，得到外泌体水凝胶伤口敷料。
[0032]目前，伤口敷料水凝胶普遍为固态物质，一般需要进行交联反应，配置方法复杂，并且很容易出现水凝胶与有效成分混合不均、达不到缓释作用、影响有效成分效果的弊端。而本发明中采用的水凝胶为温敏性水凝胶，在低温下呈液态，制备过程中容易与外泌体混合均匀，配置方法简单，配置过程在低温环境下进行，能有效避免外泌体的功效被破坏。在伤口的过程中，本发明的敷料不仅不需要经常更换，还能达到缓释、促进伤口愈合的效果。另外，本发明的敷料与伤口的接触面积更大，更容易吸收软组织渗出液，缩短伤口愈合时间。
[0033]本发明中，B液中间充质干细胞外泌体的浓度为200-400μg/mL。
[0034]本发明中，A液与B液按体积比1:1混合。
[0035]本发明对间充质干细胞外泌体的来源及制备方法没有特殊限定，已知间充质干细胞外泌体均能够用于本发明的伤口敷料。可选的，本领域技术人员也可根据已知间充质干细胞外泌体的制备方法进行制备。作为一种可实施的方式，本发明中，间充质干细胞外泌体为从间充质干细胞培养基的上清液中提取得到，将上清液转移至50mL离心管中，在4℃环境
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