(10)申请公布号 (43)申请公布日 2014.07.23
C N 103936848
A (21)申请号 201410097427.8
(22)申请日 2014.03.14
C07K 14/575(2006.01)
C07K 1/20(2006.01)
C07K 1/04(2006.01)
(71)申请人深圳翰宇药业股份有限公司
地址518057 广东省深圳市南山区高新技术
工业园中区翰宇生物医药园办公大楼
四层
(72)发明人宓鹏程 刘建 马亚平 袁建成
(74)专利代理机构北京北翔知识产权代理有限
公司 11285
代理人张广育 姜建成
(54)发明名称
(57)摘要
本发明涉及胸腺肽α1的非线性固相合成方
法，方法特征在于偶联Ser-Ser 片段时，偶联的位 点是Ser 的侧链羟基而不是常规的N 端氨基。待肽
链合成后，在合适的条件下进行，酯键会重组形成
酰胺结构，从而得到胸腺肽α1。本发明的方法相
对于传统的线性固相合成方法而言，不仅保持了
操作简便、后处理容易等优点，还由于降低β-折
叠带来的偶联困难以及缓解空间位阻等效应而带
来收率高、
纯度好的优势，为胸腺肽α1的大规模生产提供了一种全新的思路。
(51)Int.Cl.
权利要求书2页 说明书9页
序列表1页
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书2页 说明书9页序列表1页(10)申请公布号CN 103936848 A
1.一种合成胸腺肽α
的方法，包括下述步骤：
1
（1）以Rink Amide树脂为载体，与Fmoc-Asp-OtBu合成Fmoc-Asp(树脂)-OtBu，然后的肽序，采用固相多肽合成方法在Fmoc-Asp(树脂)-OtBu的基础上从C端按照胸腺肽α 1
到N端逐一偶联氨基酸，在此步骤中，偶联的最后一个氨基酸为胸腺肽α
肽序中N端第9
1
位的丝氨酸，得到如下的肽树脂A:
Boc-Ser-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtB u)-Asp(树脂)-OtBu；
（2）用Fmoc-Ser(tBu)-OH与上述肽树脂A的N端的丝氨酸的游离羟基反应，形成酯键。
的肽序，采用固相多肽合成方法顺序偶联余下的氨基酸，且用乙酰基封然后按照胸腺肽α
1
闭末端丝氨酸，得到如下的肽树脂B
Boc-Ser((Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ala-Ala-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Ac)) -Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Ly s(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp(树脂)-OtBu；
（3）将肽树脂B进行裂解，得到如下的多肽片段b:
-Ser(O-Ser-Thr-Asp-Thr-Val-Ala-Ala-Asp-Ser-Ac)-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp NH
2
-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH；
（4）将多肽片段b溶于缓冲盐体系中，在适合的条件下，多肽片段b中的酯键发生结构
：
重组，得到胸腺肽α
1
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Gl u-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH。
2.权利要求1的方法，其中，步骤（1）中的树脂选自Rink Amide AM树脂、Sieber树脂或Rink Amide MBHA树脂，且得到的Fmoc-Asp(树脂)-OtBu的替代度为0.2-0.5mmol/g。
3.权利要求1的方法，其中，步骤（1）中的固相多肽合成方法在偶联剂的存在下进行，其中，除偶联最后一个丝氨酸的偶联过程之外，所用的偶联剂选自DIPCDI/HOBt、PyBOP/HOBt/DIPEA、TBTU/HOBt/DIPEA或HBTU/HOBt/DIPEA，优选HBTU，HOBt和DIPEA 的组合物，该组合物中各成分之间以及与待偶联的氨基酸的比例以摩尔比计为氨基酸:HBTU:HOBt:DIPEA=1:1:1.2:2。
4.权利要求1的方法，其中，在步骤（1）中，在偶联最后一个丝氨酸的情况中，所用的偶联剂为DIPCDI和HOBt的组合物，该组合物中各成分之间以及与待偶联的丝氨酸的比例以摩尔比计为丝氨酸：DIPCDI：HOBt=1:1.2:1.2。
5.权利要求1的方法，其中，在步骤（2）中，Fmoc-Ser(tBu)-OH与肽树脂A的N端的丝氨酸的游离羟基
偶联过程中所用的偶联体系为HATU，HOAt，TMP和DMAP的组合物，该组合物中各成分之间以及与待偶联的Fmoc-Ser(tBu)-OH的比例以摩尔比计为Fmoc-Ser(tBu)-OH：HATU：HOAt：TMP：DMAP=1:1:1.2:2:0.05。
6.权利要求1的方法，其中，在步骤（2）中，乙酰基封闭末端丝氨酸过程在封闭液的存在下进行，所述封闭液为以摩尔比计为1:1的吡啶和乙酸酐的混合溶液。
7.权利要求1的方法，其中，步骤（3）中的裂解过程在裂解液的存在下进行，所述裂解
液为以体积比计TFA：EDT：H
O=92:5:3的混合溶液，用量为1g肽树脂对应8-12ml裂解液，
2
裂解时间为1-3小时。
8.权利要求1的方法，其中，步骤（4）中所述的缓冲盐的水溶液为0.1M的磷酸氢二钠水溶液或0.2M醋酸铵水溶液。
9.权利要求1的方法，其中，步骤（4）中合适的条件为多肽片段b的浓度为2mg/ml水溶液，反应pH值为7.2～7.5，反应温度为0～37℃，反应时间为30分钟至20小时。
10.权利要求1-9中任一项的方法，还包括胸腺肽α
的纯化步骤，所述纯化步骤采用
1
反相高压液相谱法，包括以反相十八烷基硅烷为固定相，以0.2体积%三氟乙酸的乙腈溶液或体积比为85:15的水和乙腈为流动相，收集目的峰馏分，浓缩冻干。
胸腺肽α
的合成方法
1
技术领域
[0001] 本发明涉及一种多肽的合成方法，更具体而言，涉及胸腺肽α1的合成方法。
背景技术
[0002] 胸腺肽α1（Thymosinα1，后文也简称Tα1）是从牛胸腺制备物TF5（Thymosin fraction5）中分离出的一个酸性多肽，其序列如下：
[0003] Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Ly s-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH
[0004] Tα1的生物活性比牛胸腺制备物TF5更高。具体而言，Tα1可促进T淋巴细胞在胸腺内增生及成熟、增加淋巴细胞分泌IL-2、α及r干扰素、增强IL-2受体的表达作用。
可增强NK细胞的数量和活性，通过对辅助T细胞、细胞毒淋巴细胞及NK细胞等此外，Tα
1
免疫细胞的增殖作用，间接地杀死被病毒感染的肝细胞及肿瘤细胞。目前，胸腺肽α
作为
1
免疫增强剂被广泛地用于重度感染、肝炎和肿瘤的免疫。
[0005] 目前，合成胸腺肽α1主要采用固相合成法：
[0006] 中国专利申请CN102199205A公开了一种制备胸腺肽α1的方法。其中，以羟基官能树脂做载体、顺序偶联氨基酸得到胸腺肽α
肽树脂，TFA裂解得到粗肽，粗肽纯度为
1
52.6%～69.6%。
[0007] 中国专利CN101104638B公开了一种制备胸腺肽α1的方法。其中，以氨基官能树
肽树脂为载体，将氨基偶联至Asp的侧链羧基上，然后顺序偶联各氨基酸得到胸腺肽α
1
脂，最后TFA裂解得到胸腺肽α
，粗肽纯度为60%。总收率为20%。
1
[0008] 本领域技术人员已知，胸腺肽α1的两个区段(Ser1-Glu10和Ile11-Asn28)之间易
非常困难。
形成β-折叠结构，这造成用现有的固相合成多肽的方法来合成胸腺肽α
1
[0009] 因此，仍需要开发一种新的合成胸腺肽α1的方法，其可降低由于β-折叠而带来的偶联困难。
发明内容
[0010] 现有技术合成胸腺肽α1的固相方法中，第一个参与偶联的氨基酸均是Asn或
的肽序进行线性偶联，这个过程中不可避免地存在β-折叠现象。Asp，且均按照胸腺肽α
1
此外，由于大量侧链保护基的存在，线性偶联也必然存在较大的空间位阻。
[0011] 本发明在实验过程中意外地发现，采用一种非线性偶联方法，能够有效地降低由于β-折叠带来的偶联困难、缓解空间位阻现象，进而提高产品收率。
[0012] 因此，本发明的目的是提供一种合成胸腺肽α1的方法，具体提供一种合成胸腺肽的非线性固相合成方法，其包括下述步骤：
α
1
[0013] （1）以Rink Amide树脂为载体，与Fmoc-Asp-OtBu合成Fmoc-Asp(树脂)-OtBu，的肽序，采用固相多肽合成方法在Fmoc-Asp(树脂)-OtBu的基础上从然后按照胸腺肽α
1
C端到N端逐一偶联氨基酸，在此步骤中，偶联的最后一个氨基酸为胸腺肽α
肽序中N端
1
第9位的丝氨酸，得到如下的肽树脂A:
[0014] Boc-Ser-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(B oc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Gl u(OtBu)-Asp(树脂)-OtBu；
[0015] （2）用Fmoc-Ser(tBu)-OH与上述肽树脂A的N端的丝氨酸的游离羟基反应，形成酯键。然后按照胸腺肽α
的肽序，采用固相多肽合成方法顺序偶联余下的氨基酸，且用乙
1
酰基封闭末端丝氨酸，得到如下的肽树脂B
[0016] Boc-Ser((Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ala-Ala-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Ac))-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtB u)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp(树脂)-OtBu；
[0017] （3）将肽树脂B进行裂解，得到如下的多肽片段b:
[0018] NH2-Ser(O-Ser-Thr-Asp-Thr-Val-Ala-Ala-Asp-Ser-Ac)-Glu-Ile-Thr- Thr-Lys -Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH；
[0019] （4）将多肽片段b溶于缓冲盐水溶液中，在适合的条件下，多肽片段b中的酯键发生重组，得到胸腺肽α
：
1
[0020] Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Ly s-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH。
[0021] 本发明的胸腺肽α1的固相合成方法是一种新的非线性固相合成方法，其相对于传统的线性固相合成方法而言，不仅保持了操作简便、后处理容易等优点，还由于降低β-折叠带来的偶联困难以及缓解空间位阻等效应而带来收率高、纯度好的优势，为胸腺肽的大规模生产提供了一种全新的思路。
α
1
具体实施方式
[0022] 术语解释
[0023] 本文通篇的术语“固相多肽合成方法”、“固相合成方法”是指多肽合成领域已知的Fmoc固相合成方法，例如记载于Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis:A Practical Approach,W.C.Chan,Peter D.White著，March2,2000（ISBN-10:0199637245），英国Oxford University Press。
[0024] 本文通篇的术语“线性固相合成”是常规的Fmoc固相合成方法，即按照多肽的肽序依次顺序偶联氨基酸。
[0025] 本文通篇的术语“非线性固相合成”是一种非常规Fmoc固相合成方法，具体而言，将多肽分成若干个片段再将该若干个片段偶联，或者，利用氨基酸中除氨基和羧基之外的游离官能团（如羟基）来进行额外的反应，形成侧链，再偶联氨基酸。
[0026] 本文通篇的术语“肽树脂”是指多肽的C端连有树脂的多肽树脂。
[0027] 本文通篇的术语“多肽片段”是指上文提及的“肽树脂”脱除C端树脂而露出游离羧基的多肽。
[0028] 本文在方法步骤（2）中肽树脂B的酯键以丝氨酸后括号的形式表示，且括号中的内容表示酯键连接的侧链部分，具体而言
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议