(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811303109.7
(22)申请日 2018.11.02
(71)申请人 温州启星生物技术有限公司
地址 325001 浙江省温州市高新技术产业
园区10号小区中试大楼205室
(72)发明人 高基民 李帆帆
(74)专利代理机构 北京阳光天下知识产权代理
事务所(普通合伙) 11671
代理人 赵飞
(51)Int.Cl.
C12N 5/10(2006.01)
C12N 15/867(2006.01)
A61K 35/17(2015.01)
A61P 35/00(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本申请提供了一种针对恶性肿瘤表面
Nectin -4双靶点的第四代嵌合抗原受体T(CAR - T)细胞(表达IL -7和CCL19)的构建与应用。本发 明以Nectin -4抗原的两个空间表位为靶点，构建
的第四代CAR -T用于表达Nectin -4抗原的恶
性实体瘤，以解决CAR -T在实体瘤时的免疫
逃逸问题；并且构建第四代CAR -T可增强其增殖
能力和持续存活能力，从而有效实体瘤，并
为实体瘤术后复发/转移的有效防治提供新策
略。
权利要求书1页 说明书11页序列表8页 附图5页CN 109504660 A 2019.03.22
C N 109504660
A
1.一种第四代CAR -T细胞，所述CAR -T细胞的CAR包括胞膜外抗原结合区、铰链区和胞内信号传导区、细胞因子信号区，其特征在于：
所述胞膜外抗原结合区为用于结合X靶标抗原的anti -X scFv1和anti -X scFv2，X为Nectin4；
所述胞内信号传导区为CD8α-41BB -CD3ζ；
所述细胞因子信号区为Y和Z，Y为IL7，Z为CCL19。
2.根据权利要求1所述的第四代CAR -T细胞，其特征在于：利用X靶标抗原在恶性肿瘤细胞中表达，但在正常细胞中不表达，构建的双靶点CAR -T细胞只识别表达X靶标抗原的肿瘤细胞，而不识别正常细胞。
3.根据权利要求1所述的第四代CAR -T细胞，其特征在于：所述T细胞中CAR结合的抗原表位位于靶标抗原X的lgV样结构域。
4.权利要求1-3任一权利要求所述的第四代CAR -T细胞的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤1、构建表达X CAR1&CAR2-Y -Z慢病毒载体；
步骤2、慢病毒包装：得到表达X CAR1&CAR2-Y -Z慢病毒；
步骤3、慢病毒感染T细胞：分离人外周血单核细胞，培养和扩增T细胞，利用步骤2得到的表达X CAR1&CAR2-Y -Z慢病毒感染T细胞，得到表达X CAR1&CAR2-Y -Z的T细胞，即X双靶点的第四代CAR -T细胞。
5.根据权利要求所4述的CAR -T细胞的构建方法，其特征在于：所述构建表达X CAR1&CAR2-Y -Z慢病毒载体的过程中，包括步骤如下：
步骤1、构建表达Nectin4 CAR1&CAR2-IL7-CCL19慢病毒载体：将Nectin4 CAR1和Nectin4 CAR2基因序列分别克隆到Plenti载体EcoRI和MluI位点之间，所获得的载体命名为Plenti -Nectin4 CAR1和Plenti -Nectin4 CAR2；将Plenti -Nectin4 CAR2基因序列通过NdeI位点酶切，将IL7-CCL19融合基因克隆到Plenti -Nectin4 CAR2序列下游NdeI和MluI位点之间，所获得的载体命名为Plenti -Nectin4 CAR1&CAR2-IL7-CCL19；
步骤2、慢病毒包装：293T细胞培养于含10％FBS和1％青链双抗的DMEM培养基，细胞贴壁后密度达到70％，细胞换成含10％FBS的OPTI -MEM培养基；质粒按Plenti -Nectin4 CAR1&CAR2-IL7-CCL19：Plp1：Plp2：PMD2G＝18：9：4：3比例混合后加到PBS中混匀，PEI加到等量PBS中混匀，静置5分钟后，将两者混合后静置20分钟，均匀加到293T细胞中；细胞恒温培养箱培养48小时后，收集上清，1500rpm室温离心10min，弃细胞沉淀，上清过0.45um滤膜，即为表达Nectin4 CAR1&CAR2-IL7-CCL19的慢病毒，-80℃保存备用；
步骤3、慢病毒感染T细胞：分离人外周血单核细胞，培养和扩增T细胞，利用步骤2得到的表达Nectin4 CAR1&CAR2-IL7-CCL19慢病毒感染T细胞，得到表达Nectin4 CAR1&CAR2-IL7-CCL19的T细胞。
6.权利要求1-3任一权利要求所述的第四代CAR -T细胞在表达Nectin4靶标抗原的恶性肿瘤中的应用。
权 利 要 求 书1/1页CN 109504660 A
一种第四代CAR-T细胞及其构建方法和应用
技术领域
[0001]本发明属于生物技术工程领域，具体涉及到针对恶性肿瘤表面Nectin-4双 靶点的第四代嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞(表达IL-7和CCL19)的构建与 应用。
背景技术
[0002]随着全球环境因素的不断恶化，无论发达国家或发展中国家，恶性肿瘤的 发病率和死亡率均呈上升趋势，恶性肿瘤已成为人类生命健康的最大危害。中 国2015年约有430万人确诊癌症，280万人因癌症去世，其中大多数为实体瘤 (如肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、大肠癌、膀胱癌等)，预计到2020年，中国 每年将有550万新发癌症病例，其中死亡人数将达400万。由于传统方 法的固有缺陷以及全球生物高新技术的火热发展，人们对新疗法的出现期待已 久。而生物作为刚崭露头角的全新理念，由于其所具有的特有优点， 必将为癌症患者所广泛接受。
[0003]CAR-T疗法是一种以嵌合型抗原受体为基础的细胞免疫方案。其通过 体外基因转移技术，将编码嵌合抗原受体(CAR)的基因序列转导入T细胞中， 生成可以结合靶抗原的肿瘤特异性T细胞。近几年，CAR-T疗法在恶性血 液肿瘤中取得的成果是有目共睹的(如针对难治性/复发性急性B淋巴母细胞 白血病的Kymriah和针对难治性/复发性非何杰金氏淋巴瘤的Yescarta去年已在 美国上市)，但至少50％以上的会复发率，且CAR-T细胞实体瘤效果不佳， 主要原因是存在缺乏合适的靶抗原、CAR-T细胞在体内持续时间短、免疫逃逸、 免疫抑制肿瘤微环境等颇具挑战的问题。因此，目标抗原的选择对于CAR的 特异性、有效性以及基因改造的T细胞自身安全性来讲都至关重要。
[0004]Nectin-4是属于Nectin蛋白家族的I型跨膜蛋白，其胞外区由三个Ig样结 构域(V-C-C型)组成，与钙粘蛋白共同参与了粘附连接的形成和维持。Nectin-4 在人胚胎细胞普遍表达，但在成人正常组织中却几乎不表达。Nectin-4在非小 细胞肺癌、乳腺癌、膀胱癌、胰腺癌细胞表面呈高表达，且在这些上皮源性恶 性肿瘤的发生、浸润及转移过程中发挥关键性作用，可成为癌症的可靠靶 点。靶向Nectin-4的抗体偶联药物Enuteumab vedotin因在81例晚期膀胱癌的 I期临床试验中疗效出(例如，铂类化疗耐药的患者中客观反应率41％，其 中19例肝转移患者中的有效率为47％；甚至在32例PD-1/PD-L1抑制剂 无效的患者中有效率达44％)，从而在2018年3月获得了FDA突破性疗法认 定，目前正在临床研究中用于患有实体瘤的患者。
[0005]本发明中的第四代CAR-T细胞在CD3ζ传导的第一信号和4-1BB共刺激 分子传导的第二信号的基础
上，选择IL-7和CCL-19细胞因子作为第三信号。 细胞因子在传递信息，激活与调节免疫细胞，介导T、B细胞活化、增殖与分 化及在炎症反应中发挥重要作用。其中，IL-7在促进T细胞增殖同时可以维持 T细胞稳定，CCL-19可以募集外周T细胞及DC(树突状细胞)进入淋巴组织， 进而解决CAR-T细胞在体内持续时间短、免疫抑制肿瘤微环境等颇具挑战的 问题。
发明内容
[0006]本发明主要是基于CAR-T细胞恶性实体瘤时存在缺乏合适的靶抗原、 CAR-T 细胞在体内持续时间短、抗原逃逸等颇具挑战的难题而提供的一种针对 恶性肿瘤表面Nectin-4抗原两个表位的第四代嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞 (表达IL-7和CCL19)的构建及应用。
[0007]通过基因工程技术构建plenti-Nectin4CAR1-P2A-Nectin4CAR2-IL7-CCL19 质粒载体，然后利用高滴度，高纯度的慢病毒规模化生产工艺包装出慢病毒载 体以转染T细胞，培养五天后通过流式分别检测两种CAR的表达率，并通过 不同方法检测CAR-T细胞对Nectin4阳性细胞的体外杀伤作用。
[0008]本发明采用以下技术方案：
[0009]一种第四代CAR-T细胞，所述CAR-T细胞的CAR包括胞膜外抗原结合区、 铰链区和胞内信号传导区、细胞因子信号区，所述胞膜外抗原结合区为用于结 合X靶标抗原的anti-X scFv1和anti-X scFv2，X
为Nectin4；所述胞内信号传导 区为CD8α-41BB-CD3ζ；所述细胞因子信号区为Y和Z，Y为IL7，Z为 CCL19。
[0010]进一步地，利用X靶标抗原在恶性肿瘤细胞中表达，但在正常细胞中不表 达，构建的双靶点CAR-T细胞只识别表达X靶标抗原的肿瘤细胞，而不识别 正常细胞。
[0011]进一步地，所述T细胞中CAR结合的抗原表位位于靶标抗原X的lgV样 结构域。[0012]根据本发明的又一发明目的，提供了一种第四代CAR-T细胞细胞的构建 方法，包括如下步骤：
[0013]步骤1、构建表达X CAR1&CAR2-Y-Z慢病毒载体；
[0014]步骤2、慢病毒包装：得到表达X CAR1&CAR2-Y-Z慢病毒；
[0015]步骤3、慢病毒感染T细胞：分离人外周血单核细胞，培养和扩增T细胞， 利用步骤2得到的表达X CAR1&CAR2-Y-Z慢病毒感染T细胞，得到表达X CAR1&CAR2-Y-Z的T细胞，即X双靶点的第四代CAR-T细胞。
[0016]进一步地，所述构建CAR表达载体的过程中，包括步骤如下：
[0017]步骤1、构建表达Nectin4CAR1&CAR2-IL7-CCL19慢病毒载体：将Nectin4 CAR1和Nectin4CAR2
基因序列分别克隆到Plenti载体EcoRI和MluI位点之间， 所获得的载体命名为Plenti-Nectin4CAR1和Plenti-Nectin4CAR2；将 Plenti-Nectin4CAR2基因序列通过NdeI位点酶切，将IL7-CCL19融合基因克隆 到Plenti-Nectin4CAR2序列下游NdeI和MluI位点之间，所获得的载体命名为 Plenti-Nectin4CAR1&CAR2-IL7-CCL19；
[0018]步骤2、慢病毒包装：293T细胞培养于含10％FBS和1％青链双抗的DMEM 培养基，细胞贴壁后密度达到70％，细胞换成含10％FBS的OPTI-MEM培养 基；质粒按Plenti-Nectin4CAR1&CAR2-IL7-CCL19：Plp1：Plp2：PMD2G＝18： 9：4：3比例混合后加到PBS中混匀，PEI加到等量PBS中混匀，静置5分钟 后，将两者混合后静置20分钟，均匀加到293T细胞中；细胞恒温培养箱培养 48小时后，收集上清，1500rpm室温离心10min，弃细胞沉淀，上清过0.45um 滤膜，即为表达Nectin4CAR1&CAR2-IL7-CCL19的慢病毒，-80℃保存备用；[0019]步骤3、慢病毒感染T细胞：分离人外周血单核细胞，培养和扩增T细胞， 利用步骤2得到的表达Nectin4CAR1&CAR2-IL7-CCL19慢病毒感染T细胞， 得到表达Nectin4CAR1& CAR2-IL7-CCL19的T细胞。
[0020]根据本发明的另一发明目的，上述的第四代CAR-T细胞在表达 Nectin4靶标抗原的恶性肿瘤中的应用。
[0021]由上述技术方案可以看出，本发明具有以下有益效果：
[0022]一.本发明涉及到的CAR-T细胞针对的靶点是恶性肿瘤细胞表面的 Nectin-4抗原，而目前针对该靶点的疗法只有作为抗体偶联药物Enuteumab vedotin获得了FDA疗法认定。
[0023]二.本发明以Nectin-4的两个抗原表位为靶点，减少了靶向“压力” 下形成免疫逃逸而引起恶性肿瘤复发。
[0024]三.本发明中的第四代CAR-T是将IL-7以及CCL-19基因转入CAR-T细 胞，其中CCL-19可以募集外周T细胞及DC(树突状细胞)进入淋巴组织， 而IL-7在促进T细胞增殖同时可以维持T细胞稳定。
[0025]下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步的详细说明。
附图说明
[0026]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实 施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描 述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出 创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
[0027]图1是通过免疫组化检测人源性恶性肿瘤组织中Nectin4的表达情况。
[0028]图2是通过流式细胞术检测人源性恶性肿瘤细胞表面Nectin4抗原的表达 情况。[0029]其中，HT13
76(人膀胱癌细胞株)，PANC/1(人胰腺癌细胞株)，HCCLM3 (人肝癌细胞株)，MB453、MB231、MCF7(人乳腺癌细胞株)。
[0030]图3是三种CAR的示意图。
[0031]其中，a.Plenti-Nectin4CAR1-IL7-CCL19重组质粒b.Plenti-Nectin4 CAR2-IL7-CCL19重组质粒c.Plenti-Nectin4CAR1-P2A-Nectin4 CAR2-IL7-CCL19重组质粒。[0032]图4是利用第三代慢病毒包装体系制备CAR病毒颗粒(滴度为 5x10e8TU/ml)，以MOI＝40感染人原代T细胞，流式细胞术检测Nectin4CAR 在T细胞膜上的表达情况。[0033]图5是通过RTCA(实时无细胞标记分析技术)体外验证E:T＝20：1条件 下第四代CAR-T细胞对Nectin4阳性的人膀胱癌细胞HT1376的杀伤作用，以 未转导病毒的T细胞和CD19CAR-T为对照，比较Nectin4CAR1-IL7-CCL19、 Nectin4CAR2-IL7-CCL19、Nectin4CAR1& CAR2-IL7-CCL19三种第四代CAR-T 的体外杀伤效果。
[0034]图6是通过荧光素酶法体外验证不同效靶比条件下Nectin4 CAR1-IL7-CCL19、Nectin4CAR2-IL7-CCL19、Nectin4CAR1&CAR2-IL7-CCL19 这三种第四代CAR-T细胞对Nectin4阳性并通过慢病毒转染使其表达荧光素酶 的人膀胱癌细胞HT1376的杀伤作用。[0035]图7是构建Plenti-Nectin4CAR1和Plenti-Nectin4CAR2重组质粒的相关电 泳图。[0036]其中，a.pUC57-Nectin4CAR1-Amp和pUC57-Nectin4CAR2-Amp重组质粒 经EcoRI-HF和MluI-HF限制性内切酶双酶切分别得目的条带1458bp、1464
bp. b.Plenti vector经EcoRI-HF和MluI-HF限制性内切酶双酶切得目的条带7302bp. c.Plenti-Nectin4CAR1重组质粒经AFLII-HF酶切得目的条带2033bp、3071bp、 3656bp，Plenti-Nectin4CAR2重组质粒
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